Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungs-Radioliganden-behandeltes Gewebe (FACS-RTT) zur Bestimmung des zellulären Ursprungs des radioaktiven Signals
Summary
Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle des 18-kDa-Translokatorproteins oder der Serotonin-5HT-2A-Rezeptorexpression bei der Alzheimer-Krankheit auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Ex-vivo-Anwendung von FACS-RTT im Rattenmodell TgF344-AD.
Abstract
Gliazellen haben wahrscheinlich eine erhebliche Bedeutung in der Pathophysiologie neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit (AD). Ihre Veränderungen sind vielleicht mit einem entzündungsfördernden Zustand verbunden. Der Rattenstamm TgF344-AD wurde entwickelt, um menschliche APP- und menschliche PS1ΔE9-Gene zu exprimieren, die für die Amyloidproteine Aβ-40 und Aβ-42 kodieren und Amyloidpathologie und kognitive Defizite mit zunehmendem Alter aufweisen. Das TgF344-AD-Rattenmodell wird in dieser Studie verwendet, um den zellulären Ursprung der Bindung des 18-kDa-Translokatorproteins (TSPO, ein Marker für die Aktivierung von Gliazellen) und der Serotoninrezeptorspiegel des5HT 2A-Rezeptors (5HT2A R) zu bewerten, die möglicherweise bei AD gestört sind. Die hier vorgestellte Technik ist Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), eine quantitative zelltypspezifische Technik, die di vivo PET oder SPECT oder ex vivo/in vitro Autoradiographietechniken ergänzt. Es quantifiziert den gleichen radioaktiv markierten Tracer, der zuvor für die Bildgebung verwendet wurde, unter Verwendung eines γ-Zählers nach der Zellsortierung der Zytometrie. Dies ermöglicht es, den zellulären Ursprung des radioaktiv markierten Proteins mit hoher zellulärer Spezifität und Sensitivität zu bestimmen. Zum Beispiel zeigten Studien mit FACS-RTT, dass (i) die Zunahme der TSPO-Bindung mit Mikroglia in einem Rattenmodell von Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Neuroinflammation assoziiert war, (ii) eine Zunahme der TSPO-Bindung nach 12 und 18 Monaten zuerst mit Astrozyten und dann mit Mikroglia bei den TgF344-AD-Ratten im Vergleich zu Wildtyp-Ratten (WT) assoziiert war, und (iii) die striatale Dichte von 5HT2A R nimmt in Astrozyten nach 18 Monaten im selben Ratten-AD-Modell ab. Interessanterweise kann diese Technik auf praktisch alle Radiotracer ausgedehnt werden.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD) sind durch einen neuronalen Verlust gekennzeichnet, der mit erhöhten Symptomen einhergeht. AD, die häufigste Ursache für Demenz, die 60% -70% der Fälle ausmacht, betrifft weltweit rund 50 Millionen Menschen1. Auf neuropathologischer Ebene sind die beiden Hauptmerkmale von AD die Ansammlung von extrazellulären Amyloid-β (Aβ) -Plaques und intrazellulären Tau-Neurofibrillenverwicklungen. Gliazellveränderungen wurden auch mit AD2 und einer möglichen Störung mehrerer Neurotransmittersysteme in Verbindung gebracht 3,4.
Die TgF344-AD-Rattenlinie wurde modifiziert, um AD zu modellieren, indem humane APP- und PS1ΔE9-Transgene exprimiert wurden, was zu einer löslichen und unlöslichen Aβ-40- und Aβ-42-Expression und Amyloid-Plaquebildungführte 5. Es zeigt auch die Anhäufung von hyperphosphorylierten Formen des Tau-Proteins, die zur Tauopathie führen. Ab dem Alter von 9-24 Monaten entwickeln die Ratten allmählich die pathologischen Merkmale von AD und eine kognitive Beeinträchtigung 5,6,7,8,9.
Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und Autoradiographie sind Techniken, die auf der Emission und Quantifizierung von γ Strahlen basieren. Radiotracer werden entweder in vivo (PET und SPECT) oder ex vivo/in vitro (Autoradiographie) quantifiziert. Diese empfindlichen Techniken haben zum Verständnis der Mechanismen verschiedener Gehirnerkrankungen wie AD beigetragen. Tatsächlich gibt es in Bezug auf Neuroinflammation viele Studien, in denen 18 kDa Translocator Protein (TSPO), ein in vivo Neuroinflammation Marker, mit radioaktiv markierten Tracern wie [11 C]-(R)-PK11195 oder [11C]PBR28 bewertet wird (zur Überprüfung siehe 10). Darüber hinaus wurden Veränderungen von Neurotransmittersystemen mit Radiotracern11,12,13 untersucht.
Diese Techniken bestimmen jedoch nicht den zellulären Ursprung des radioaktiven Signals. Dies könnte die Interpretation der biologischen Grundlagen der Veränderung der Bindung eines Radioliganden in PET/SPECT behindern. Im Falle von TSPO-Studien zur Neuroinflammation ist es beispielsweise von größter Bedeutung zu verstehen, ob der Anstieg oder Rückgang des TSPO auf astrozytäre oder mikrogliale Veränderungen zurückzuführen ist. Die FACS-RTT-Technik (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) wurde entwickelt, um diese Probleme zu umgehen und die Beurteilung der Radioligandenbindung in jedem Zelltyp separat und die Quantifizierung der Zielproteindichte pro Zelle zu ermöglichen. Diese innovative Technik ist daher komplementär und hochgradig kompatibel mit PET- und SPECT-Bildgebung.
Hier wurde diese Technik entlang zweier Achsen angewendet: der Untersuchung der Neuroinflammation mit TSPO-spezifischen Radioliganden und der Beurteilung des serotonergen Systems. Auf der ersten Achse ging es darum, den zellulären Ursprung des TSPO-Signals als Reaktion auf eine akute Entzündungsreaktion zu verstehen. Daher wurde FACS-RTT am Hirngewebe von Ratten nach der Induktion einer Neuroinflammation über eine Lipopolysaccharid (LPS) -Injektion und nach einer in vivo [125I]CLINDE SPECT Bildgebungsstudie eingesetzt. Darüber hinaus wurden die gleiche Bildgebung und das FACS-RTT-Protokoll auf 12 und 24 Monate alte TgF344-AD-Ratten und passende Wildtyp-Ratten (WT) angewendet. Die zweite Achse zielte darauf ab, den Ursprung serotoninerger Systemveränderungen in diesem Rattenmodell durch ex vivo 5-HT2AR Dichtebewertung nach Zelltyp zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unseres Wissens war diese Technik die erste, die einen Ansatz beschrieb, der ein besseres Verständnis von in vivo bindenden Veränderungen eines Radiotracers auf zellulärer Ebene ermöglicht. Das Protokoll beschreibt eine Multiskalenmethode zur Quantifizierung der Radiotracerbindung auf zellulärer Ebene am Beispiel von [125I]CLINDE (TSPO) oder [125I]R91150 (5HT2AR).
Diese Technik ist robust und empfindlich genug, um den zellulären Ursprung eines br…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (Förderkennzeichen 320030-184713) unterstützt. Die Autoren BBT und KC werden von der Velux Foundation (Projekt Nr. 1123) unterstützt. Autor ST erhielt Unterstützung vom Schweizerischen Nationalfonds (Early Post-Doc Mobility Scholarship, Nr. P2GEP3_191446), die Prof. Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus Stipendium) und die Jean and Madeleine Vachoux Foundation.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
Riferimenti
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