Свободно плавающее иммуноокрашание мозга мыши
Summary
Этот протокол описывает эффективный и воспроизводимый подход к гистологическим исследованиям мозга мышей, включая перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию.
Abstract
Иммуногистохимическое окрашивание мозга мыши является рутинным методом, обычно используемым в неврологии для исследования центральных механизмов, лежащих в основе регуляции энергетического обмена и других нейробиологических процессов. Однако качество, надежность и воспроизводимость результатов гистологии мозга могут варьироваться в зависимости от лаборатории. Для каждого эксперимента по окрашиванию необходимо оптимизировать ключевые процедуры, основанные на различиях в видах, тканях, целевых белках и условиях работы реагентов. Эта статья демонстрирует надежный рабочий процесс в деталях, включая внутриаортальную перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию, за которыми могут легко следить исследователи в этой области.
Также обсуждается, как модифицировать эти процедуры для удовлетворения индивидуальных потребностей исследователей. Чтобы проиллюстрировать надежность и эффективность этого протокола, перинейрональные сетки были окрашены биотиновым меченым гглибутинином Wisteria florbunda (WFA) и аргининовым вазопрессином (AVP) антителом против AVP в мозге мыши. Наконец, были рассмотрены критические детали для всей процедуры и преимущества этого протокола по сравнению с другими протоколами. Взятый вместе, в этой статье представлен оптимизированный протокол для свободно плавающего иммуноокрашения ткани мозга мыши. Следование этому протоколу облегчает этот процесс как младшим, так и старшим ученым для улучшения качества, надежности и воспроизводимости иммуноокрашивающих исследований.
Introduction
Распространенность ожирения и связанных с ним сопутствующих заболеваний достигла уровня эпидемии, что приводит к огромному социально-экономическому бремени1,2. Различные мышиные модели были разработаны, чтобы лучше понять биологические процессы, ответственные за ожирение3,4. Поскольку центральные механизмы важны для регуляции энергетического гомеостаза на этих животных моделях, нейроанатомические исследования мозга мышей стали необходимой техникой в этой области. Тем не менее, качество, надежность и воспроизводимость методов гистологии мозга значительно различаются между лабораториями и даже исследователями в одной и той же лаборатории по разным причинам (например, антитела, ткани, методы лечения, виды, цели исследований). Поэтому необходимо установить общий протокол гистологических исследований мозга мыши, включая перфузию, сечение мозга, свободно плавающее иммуноокрашивание, крепление тканей и визуализацию. Между тем, новички могут быстро изучить, освоить и настроить этот протокол для удовлетворения своих индивидуальных потребностей.
Иммуногистохимическое окрашивание является признанным методом, который широко используется для визуализации конкретных типов клеток, мРНК и белков в различных тканях (например, мозге и периферических тканях)5,6. Более конкретно, представляющий интерес антиген может быть меченым специфическим первичным антителом и соответствующим вторичным антителом, связанным с ферментом (например, хромогенной иммуногистохимией) или флуоресцентным красителем (флуоресцеин изотиоцианат)6. В качестве примера полезности этих методов β-эндорфин [один пептид, кодируемый про-опиомеланокортином (POMC)] и c-fos (маркер нейрональной активности) были окрашены в дугообразное ядро. Было показано, что делеция триптофангидроксилазы 2 (фермента, интегрального синтеза серотонина) в дорсальном ядре рафе снижает экспрессию c-fos в нейронах POMC в дугообразном ядре7. Кроме того, распределение мРНК рецептора витамина D было нанесено на карту в мозге мыши посредством гибридизации in situ (RNAscope)8. В данной работе представлен надежный и эффективный метод с пошаговым рабочим процессом для свободно плавающего иммуноокрашения, направленный на улучшение качества и воспроизводимости гистологических исследований мозга мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обеспечивает установленный метод нейроанатомических исследований мозга мыши, включая перфузию, сечение тканей, свободно плавающее иммуноокрашивание, монтаж тканей и визуализацию. Тем не менее, несколько ключевых деталей, необходимых для последовательных и надежных рез…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследователи были поддержаны грантами NIH (K01DK119471 для CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 и R01DK120858 to YX), USDA/CRIS (51000-064-01S to YX) и постдокторская стипендия Американской кардиологической ассоциации (#829565) в LT.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
Riferimenti
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
- Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
