Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi
Summary
Hücre içi M. tuberculosis büyümesinin hızlı ve etkili bir şekilde ölçülmesi, tüberküloza (TB) karşı gelişmiş tedavilerin sürdürülmesi için çok önemlidir. Bu protokol, aday konakçı tarafından yönlendirilen tedavilerle tedavi edilen makrofajlarda Mtb büyümesini ölçmek için otomatik bir sıvı kültür sistemi kullanan et suyu bazlı bir kolorimetrik tespit testini tanımlar.
Abstract
Tüberkülozun (TB) etken maddesi olan Mycobacterium tuberculosis (Mtb), COVID-19’un ortaya çıkışına kadar dünya çapında en önemli bulaşıcı hastalık katiliydi. Mtb, hücre içi ortamında devam etmek, konakçı savunmasından kaçınmak ve birçok anti-tüberküler ilaca karşı direnç geliştirmek için evrimleşmiştir. Direnci çözmeye yönelik bir yaklaşım, Mtb’ye karşı konakçı bağışıklık tepkisini artıracak mevcut onaylanmış ilaçları tanımlamaktır. Bu ilaçlar daha sonra tedavi süresini kısaltmak ve antibiyotik direncinin üstesinden gelmeye yardımcı olmak için yardımcı konakçı yönelimli tedaviler (HDT) olarak yeniden kullanılabilir.
Makrofajlarda hücre içi Mtb büyümesinin ölçülmesi, potansiyel HDT’nin değerlendirilmesinde çok önemli bir husustur. Mtb büyümesini ölçmek için altın standart, agar plakaları üzerindeki koloni oluşturan birimleri (CFU) saymaktır. Bu, ilaçların hızlı bir şekilde taranmasına kendini ödünç vermeyen yavaş, emek yoğun bir tahlildir. Bu protokolde, klinik örneklerde Mtb’yi tespit etmek için daha yaygın olarak kullanılan otomatik, et suyu bazlı bir kültür sistemi, konakçıya yönelik tedavilerin klinik öncesi taraması için uyarlanmıştır. HDT ile tedavi edilen makrofajlarda sıvı kültür tahlil sisteminin hücre içi Mtb büyümesini araştırma kapasitesi değerlendirildi. Mtb büyümesini inhibe etme yetenekleri açısından test edilen HDT’ler, hem çözelti içinde hem de poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikropartiküllerinde ve interferon-gama ve linezolid kombinasyonunda kapsüllenmiş all-trans Retinoik asit (AtRA) idi. Bu otomatik sıvı kültür bazlı tekniğin CFU yöntemine göre avantajları, kurulumun basitliğini, daha az emek yoğun hazırlığı ve sonuçlara daha hızlı ulaşma süresini içerir (agar plakaları için 21 gün veya daha fazlasına kıyasla 5-12 gün).
Introduction
TB’nin etken maddesi olan Mycobacterium tuberculosis (Mtb), 2019 yılında dünya çapında en önemli bulaşıcı hastalık öldürücüolmuştur 1. Konakçı savunmasından kaçınmak için Mtb, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC’ler) gibi doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin mikobakterisidal aktivitesini bozar ve hücre içinde devam etmesine ve2’yi çoğaltmasına izin verir. Erişkin akciğer tüberkülozunu önlemek için etkili bir aşının bulunmaması ve ilaca dirençli suşların giderek daha fazla ortaya çıkması, yeni tedavilere olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır.
Yardımcı konak yönelimli tedaviler (HDT) tedavi süresini kısaltabilir ve direncin üstesinden gelmeye yardımcı olabilir3. Makrofajlar içindeki mikobakterisidal aktiviteyi belirlemek için HDT adaylarının in vitro preklinik değerlendirmesi, genellikle katı agar plakaları üzerinde koloni oluşturan birimler (CFU) tarafından Mtb büyümesinin miktarına dayanır. Bu, ilaçların hızlı bir şekilde taranmasına kendini ödünç vermeyen yavaş, emek yoğun bir tahlildir. Ticari olarak temin edilebilen otomatik, et suyu bazlı mikrobiyal tespit sistemleri, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında, klinik örneklerde Mtb ve diğer mikobakteriyel türlerin tespiti ve ilaca duyarlılık testi için daha yaygın olarak kullanılmaktadır4. Bu araçlar, zamanla izlenen kültür ortamındaki fiziksel değişikliklere (CO2 veya O2 seviyelerindeki veya basıncındaki değişiklik) yol açan bakteriyel metabolik aktiviteye dayanarak dolaylı olarak büyümeyi ölçer5. Okuma, daha önce 6,7 tedavisine yanıt olarak TB hastalarının balgam örneklerinde ve enfekte murin akciğer ve dalak8 lizatlarında Mtb CFU ile ilişkili olduğu gösterilen pozitiflik zamanıdır (TPP). Ek olarak, geleneksel patojene yönelik tedavilerin aksenik kültürde ve kültürlenmiş makrofajlarda mikobakterilerin büyümesi üzerindeki etkisini ölçmek için sıvı kültür tespit sistemleri kullanılmıştır 9,10. Cihaz ayrıca dendritik hücrelerin ve alveolar makrofajların Mtb 11,12’nin hücre içi büyümesini kontrol etme konusundaki doğuştan gelen yeteneğini araştırmak için kullanılmıştır. Bu deneysel protokol, kültürlü makrofajlarda TB için HDT’nin klinik öncesi taramasını gerçekleştirmek için bir sıvı kültür tanı sisteminin uyarlanabileceğini göstermektedir. CFU sayımı ile karşılaştırıldığında, bu tekniğin temel avantajı, hücre içi mikobakteriyel büyümeyi / sağkalımı ölçmek için gereken deneysel emeği ve zamanı önemli ölçüde azaltmasıdır. Bu teknik, konakçı bağışıklığını artırmak için hücresel fonksiyonları hedefleyen çok çeşitli farmakolojik reaktiflerle tedavi edilen bağışıklık hücrelerinde hücre içi mikobakteriyel sağkalımı değerlendirmek için kullanılabilecek otomatik bir kültür cihazına erişime dayanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yazarlar, monosit kaynaklı makrofajlarda ve alveoler makrofajlarda vePMA 11,16,17 ile farklılaşmış THP-1 hücrelerinde Mtb büyümesini izlemek için bu protokolde açıklanan sıvı kültür yöntemini kullanmışlardır. Bu teknik, yapışkan olmayan hücrelerle kullanım için de değiştirilebilir12. Daha yakın zamanlarda, cihaz ayrıca inhale all-trans retinoik asidi (AtRA) TB…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma İrlanda Bilim Vakfı (SFI 08 / RFP / BMT1689), İrlanda’daki Sağlık Araştırma Kurulu [HRA-POR / 2012/4 ve HRA-POR-2015-1145] ve Dublin Kraliyet Şehri Hastanesi Vakfı tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 – 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
Riferimenti
- WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , (2020).
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), 148-151 (2014).
- O’Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O’Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O’Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O’Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O’Connor, G., et al. Sharpening nature’s tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O’Sullivan, M. P., O’Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), 453-488 (2012).
