Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi
Summary
La quantificazione rapida ed efficiente della crescita intracellulare di M. tuberculosis è fondamentale per perseguire terapie migliori contro la tubercolosi (TB). Questo protocollo descrive un test di rilevamento colorimetrico basato sul brodo utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato per quantificare la crescita di Mtb nei macrofagi trattati con terapie candidate dirette dall’ospite.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agente eziologico della tubercolosi (TB), è stato il killer di malattie infettive più significativo a livello globale fino all’avvento di COVID-19. Mtb si è evoluto per persistere nel suo ambiente intracellulare, eludere le difese dell’ospite e ha sviluppato resistenza a molti farmaci antitubercolari. Un approccio per risolvere la resistenza è identificare i farmaci approvati esistenti che aumenteranno la risposta immunitaria dell’ospite alla Mtb. Questi farmaci potrebbero quindi essere riproposti come terapie aggiuntive dirette dall’ospite (HDT) per ridurre i tempi di trattamento e aiutare a superare la resistenza agli antibiotici.
La quantificazione della crescita intracellulare di Mtb nei macrofagi è un aspetto cruciale della valutazione del potenziale HDT. Il gold standard per misurare la crescita della Mtb è il conteggio delle unità formanti colonie (CFU) su piastre di agar. Questo è un test lento e laborioso che non si presta a uno screening rapido dei farmaci. In questo protocollo, un sistema di coltura automatizzato basato sul brodo, che è più comunemente usato per rilevare Mtb nei campioni clinici, è stato adattato per lo screening preclinico delle terapie dirette all’ospite. È stata valutata la capacità del sistema di analisi della coltura liquida di studiare la crescita intracellulare di Mtb nei macrofagi trattati con HDT. Gli HDT testati per la loro capacità di inibire la crescita di Mtb erano acido retinoico all-trans (AtRA), sia in soluzione che incapsulati in microparticelle di poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) e la combinazione di interferone-gamma e linezolid. I vantaggi di questa tecnica automatizzata basata su colture liquide rispetto al metodo CFU includono semplicità di configurazione, preparazione meno laboriosa e tempi di risultati più rapidi (5-12 giorni rispetto ai 21 giorni o più per le piastre di agar).
Introduction
Il Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agente eziologico della tubercolosi, è stato il killer di malattie infettive più significativo a livello globale nel 20191. Per eludere le difese dell’ospite, Mtb sovverte l’attività micobattericida delle cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche (DC), permettendogli di persistere intracellulare e replicarsi2. La mancanza di un vaccino efficace per prevenire la tubercolosi polmonare adulta e la crescente comparsa di ceppi resistenti ai farmaci evidenziano l’urgente necessità di nuove terapie.
Le terapie aggiuntive dirette dall’ospite (HDT) potrebbero ridurre i tempi di trattamento e aiutare a superare la resistenza3. La valutazione preclinica dei candidati HDT in vitro per determinare l’attività micobattericida all’interno dei macrofagi si basa spesso sulla quantificazione della crescita di Mtb da parte di unità formanti colonie (CFU) su piastre di agar solido. Questo è un test lento e laborioso che non si presta a uno screening rapido dei farmaci. I sistemi di rilevamento microbico automatizzati basati sul brodo disponibili in commercio sono più comunemente utilizzati nei laboratori di microbiologia clinica per il rilevamento e i test di sensibilità ai farmaci di Mtb e altre specie micobatteriche nei campioni clinici4. Questi strumenti misurano la crescita indirettamente in base all’attività metabolica batterica che porta a cambiamenti fisici nei terreni di coltura (variazione dei livelli di CO 2 o O2 o pressione) monitorati nel tempo5. La lettura è il tempo di positività (TPP), che ha precedentemente dimostrato di correlare con CFU Mtb in campioni di espettorato di pazienti affetti da tubercolosi in risposta al trattamento 6,7 e in lisati di polmone murino infetto e milza8. Inoltre, sono stati utilizzati sistemi di rilevamento di colture liquide per misurare l’effetto delle terapie convenzionali dirette da patogeni sulla crescita di micobatteri in coltura axenica e macrofagi in coltura 9,10. Lo strumento è stato utilizzato anche per studiare la capacità innata delle cellule dendritiche e dei macrofagi alveolari di controllare la crescita intracellulare di Mtb11,12. Questo protocollo sperimentale dimostra che un sistema diagnostico di coltura liquida può essere adattato per eseguire lo screening preclinico dell’HDT per la tubercolosi nei macrofagi in coltura. Rispetto al censimento delle CFU, il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce considerevolmente il lavoro sperimentale e il tempo necessario per quantificare la crescita/sopravvivenza micobatterica intracellulare. Questa tecnica si basa sull’accesso a uno strumento di coltura automatizzato che può essere utilizzato per valutare la sopravvivenza micobatterica intracellulare nelle cellule immunitarie trattate con una vasta gamma di reagenti farmacologici mirati alle funzioni cellulari per aumentare l’immunità dell’ospite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli autori hanno utilizzato il metodo di coltura liquida descritto in questo protocollo per monitorare la crescita di Mtb in macrofagi derivati da monociti e macrofagi alveolari e cellule THP-1 differenziate con PMA11,16,17. Questa tecnica può anche essere modificata per l’uso con cellule non aderenti12. Più recentemente, lo strumento è stato utilizzato anche in studi preclinici per valutare l’acido re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), dall’Health Research Board in Irlanda [HRA-POR/2012/4 e HRA-POR-2015-1145] e dal Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 – 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
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