מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת
Summary
כימות מהיר ויעיל של גדילת שחפת M. תוך תאית הוא חיוני להמשך טיפולים משופרים נגד שחפת ( שחפת ). פרוטוקול זה מתאר בדיקת זיהוי קולורימטרית מבוססת מרק באמצעות מערכת תרבית נוזלית אוטומטית כדי לכמת את גידול ה-Mtb במקרופאגים שטופלו בטיפולים מוכווני מארח מועמדים.
Abstract
מיקובקטריום שחפת (Mtb), הגורם הסיבתי לשחפת, היה גורם התמותה המשמעותי ביותר ממחלות זיהומיות בעולם עד להופעת COVID-19. Mtb התפתח כדי להתמיד בסביבה התוך-תאית שלו, להתחמק מהגנות המארח, ופיתח עמידות לתרופות רבות נגד שחפת. גישה אחת לפתרון עמידות היא זיהוי תרופות מאושרות קיימות שיגבירו את התגובה החיסונית של המארח ל-Mtb. לאחר מכן ניתן יהיה לשנות את ייעודן של תרופות אלה כטיפולים משלימים המכוונים על ידי מארח (HDT) כדי לקצר את זמן הטיפול ולסייע להתגבר על עמידות לאנטיביוטיקה.
כימות של גידול Mtb תוך-תאי במקרופאגים הוא היבט מכריע בהערכת HDT פוטנציאלי. תקן הזהב למדידת גידול Mtb הוא ספירת יחידות יוצרות מושבה (CFU) על לוחות אגר. זוהי בדיקה איטית, עתירת עבודה, שאינה מתאימה לסינון מהיר של תרופות. בפרוטוקול זה, מערכת תרבית אוטומטית, מבוססת מרק, המשמשת בדרך כלל יותר לאיתור Mtb בדגימות קליניות, הותאמה לסינון פרה-קליני של טיפולים מכווני מארח. הוערכה יכולתה של מערכת בדיקת התרבית הנוזלית לחקור גידול Mtb תוך-תאי במקרופאגים שטופלו ב-HDT. ה-HDTs שנבדקו על יכולתם לעכב צמיחת Mtb היו חומצה רטינואית כל-טרנסית (AtRA), הן בתמיסה והן במיקרו-חלקיקים של פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) והשילוב של אינטרפרון-גמא ולינזוליד. היתרונות של טכניקה אוטומטית זו המבוססת על תרבית נוזלית על פני שיטת CFU כוללים פשטות התקנה, הכנה פחות עתירת עבודה וזמן מהיר יותר לתוצאות (5-12 ימים לעומת 21 ימים או יותר עבור צלחות אגר).
Introduction
מיקובקטריום שחפת (Mtb), הגורם הסיבתי לשחפת, היה הרוצח המשמעותי ביותר למחלות זיהומיות בעולם בשנת 20191. כדי להתחמק מהגנות המארח, Mtb חותר תחת הפעילות המיקובקטריאלית של תאי מערכת החיסון המולדת כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs), ומאפשר לו להתמיד תוך תאית ולהשתכפל2. היעדר חיסון יעיל למניעת שחפת ריאתית למבוגרים והופעתם הגוברת של זנים עמידים לתרופות מדגישים את הצורך הדחוף בטיפולים חדשים.
טיפולים משלימים המכוונים על ידי מארח (HDT) יכולים לקצר את זמן הטיפול ולעזור להתגבר על התנגדות3. הערכה פרה-קלינית של מועמדי HDT במבחנה כדי לקבוע פעילות מיקובקטריצידלית בתוך מקרופאגים מסתמכת לעתים קרובות על כימות של גידול Mtb על ידי יחידות יוצרות מושבה (CFU) על צלחות אגר מוצקות. זוהי בדיקה איטית, עתירת עבודה, שאינה מתאימה לסינון מהיר של תרופות. מערכות זיהוי מיקרוביאליות אוטומטיות מבוססות מרק, הזמינות מסחרית, נפוצות יותר במעבדות מיקרוביולוגיה קליניות לזיהוי ובדיקת רגישות לתרופות של Mtb ומינים מיקובקטריאליים אחרים בדגימות קליניות4. מכשירים אלה מודדים גדילה בעקיפין על סמך הפעילות המטבולית החיידקית המובילה לשינויים פיזיים במדיית התרבית (שינוי ברמות CO 2 או O2 או לחץ) המנוטרים לאורך זמן5. הקריאה היא זמן לחיוביות (TPP), שבעבר הוכח כי היא מתואמת עם Mtb CFU בדגימות כיח של חולי שחפת בתגובה לטיפול 6,7 ובליזטים של ריאה וטחול מורין נגועים8. בנוסף, נעשה שימוש במערכות לזיהוי תרביות נוזליות כדי למדוד את ההשפעה של טיפולים קונבנציונליים המכוונים לפתוגנים על צמיחת מיקובקטריה בתרבית אקסנית ומקרופאגים בתרבית 9,10. המכשיר שימש גם כדי לחקור את היכולת המולדת של תאים דנדריטיים ושל מקרופאגים אלוואולריים לשלוט בצמיחה תוך-תאית של Mtb11,12. פרוטוקול ניסיוני זה מדגים כי ניתן להתאים מערכת אבחון של תרבית נוזלית לביצוע בדיקות סקר פרה-קליניות של HDT לשחפת במקרופאגים בתרבית. בהשוואה לספירה של CFU, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה במידה ניכרת את העבודה הניסיונית ואת הזמן הדרוש לכימות גדילה/הישרדות של מיקובקטריאליים תוך-תאיים. טכניקה זו מסתמכת על גישה לכלי תרבית אוטומטי שניתן להשתמש בו כדי להעריך את הישרדות המיקובקטריאליים התוך-תאיים בתאי מערכת החיסון שטופלו במגוון רחב של ריאגנטים פרמקולוגיים המכוונים לתפקודים תאיים כדי להגביר את חסינות המארח.
Protocol
Representative Results
Discussion
החוקרים השתמשו בשיטת התרבית הנוזלית המתוארת בפרוטוקול זה כדי לעקוב אחר צמיחת Mtb במקרופאגים שמקורם במונוציטים ובמקרופאגים אלוואולריים ובתאי THP-1 הממוינים ב-PMA11,16,17. טכניקה זו יכולה גם להיות שונה לשימוש עם תאים שאינם דבקים12. לא?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע של אירלנד (SFI 08/RFP/BMT1689), המועצה לחקר הבריאות באירלנד [HRA-POR/2012/4 ו-HRA-POR-2015-1145] וקרן בית החולים רויאל סיטי אוף דבלין.
Materials
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 – 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
Riferimenti
- WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , (2020).
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), 148-151 (2014).
- O’Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O’Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O’Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O’Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O’Connor, G., et al. Sharpening nature’s tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O’Sullivan, M. P., O’Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2′ epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), 453-488 (2012).
