Logiciel d’acquisition de données convivial, à haut débit et entièrement automatisé pour la cryo-microscopie électronique à particule unique
Summary
La cryo-microscopie électronique à particule unique exige un progiciel approprié et un pipeline convivial pour l’acquisition automatique de données à haut débit. Nous présentons ici l’application d’un logiciel d’acquisition d’images entièrement automatisé, Latitude-S, et un pipeline pratique pour la collecte de données de biomolécules vitrifiées dans des conditions de faible dose.
Abstract
Au cours des dernières années, les progrès technologiques et méthodologiques de la cryo-microscopie électronique à particule unique (cryo-EM) ont ouvert une nouvelle voie pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules biologiques. Malgré les progrès remarquables de la cryo-EM, il est encore possible d’améliorer divers aspects du flux de travail d’analyse d’une seule particule. L’analyse monoparticule exige un progiciel approprié pour l’acquisition automatique de données à haut débit. Plusieurs progiciels d’acquisition automatique de données ont été développés pour l’imagerie automatique pour la cryo-EM monoparticule au cours des huit dernières années. Cet article présente une application d’un pipeline d’acquisition d’images entièrement automatisé pour les biomolécules vitrifiées dans des conditions de faible dose.
Il présente un progiciel capable de collecter des données cryo-EM de manière complète, automatique et précise. De plus, divers paramètres microscopiques sont facilement contrôlés par ce progiciel. Ce protocole démontre le potentiel de ce progiciel dans l’imagerie automatisée de la protéine de pointe du syndrome respiratoire aigu sévère-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) avec un cryomicroscope électronique de 200 keV équipé d’un détecteur d’électrons direct (DED). Environ 3 000 images de films cryo-EM ont été acquises en une seule session (48 h) de collecte de données, ce qui a donné une structure de résolution atomique de la protéine de pointe du SARS-CoV-2. De plus, cette étude structurale indique que la protéine de pointe adopte deux conformations majeures, 1-RBD (domaine de liaison aux récepteurs) ouverte et toutes les conformations RBD fermées.
Introduction
La cryo-EM monoparticule est devenue une technique de biologie structurale courante pour la détermination de la structure à haute résolution des macromolécules biologiques1. La reconstruction d’une seule particule dépend de l’acquisition d’un grand nombre de micrographies d’échantillons vitrifiés pour extraire des images de particules bidimensionnelles (2D), qui sont ensuite utilisées pour reconstruire une structure tridimensionnelle (3D) d’une macromolécule biologique2,3. Avant le développement des DED, la résolution obtenue à partir de la reconstruction d’une seule particule variait entre 4 et 30 Å4,5. Récemment, la résolution réalisable de la cryo-EM à particule unique a dépassé 1,8 Å6. Le DED et les logiciels automatisés d’acquisition de données ont largement contribué à cette révolution de résolution7, où l’intervention humaine pour la collecte de données est minime. En règle générale, l’imagerie cryo-EM est réalisée à de faibles débits de dose d’électrons (20-100 e/Å2) pour minimiser les dommages causés par le rayonnement induit par le faisceau d’électrons des échantillons biologiques, ce qui contribue au faible rapport signal/bruit (SNR) de l’image. Ce faible SNR empêche la caractérisation des structures à haute résolution des macromolécules biologiques à l’aide d’une analyse monoparticulaire.
Les détecteurs d’électrons de nouvelle génération sont des détecteurs à base de CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor), qui peuvent surmonter ces obstacles à faible SNR. Ces caméras CMOS à détection directe permettent une lecture rapide du signal, grâce à laquelle la caméra contribue à une meilleure fonction d’étalement de points, à un SNR approprié et à une excellente efficacité quantique de détection (DQE) pour les macromolécules biologiques. Les caméras à détection directe offrent un SNR8 élevé et un faible bruit dans les images enregistrées, ce qui entraîne une augmentation quantitative de l’efficacité quantique du détective (DQE), une mesure de la quantité de bruit qu’un détecteur ajoute à une image. Ces caméras enregistrent également des films à la vitesse de centaines d’images par seconde, ce qui permet une acquisition rapide des données9,10. Toutes ces caractéristiques rendent les caméras à détection directe rapide adaptées aux applications à faible dose.
Les images de pile corrigées du mouvement sont utilisées pour le traitement des données afin de calculer la classification 2D et de reconstruire une carte de densité 3D de macromolécules à l’aide de divers logiciels tels que RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 et EMAN215. Cependant, pour l’analyse d’une seule particule, un énorme ensemble de données est nécessaire pour obtenir une structure à haute résolution. Par conséquent, les péages d’acquisition automatique de données sont très essentiels pour la collecte de données. Pour enregistrer de grands ensembles de données cryo-EM, plusieurs progiciels ont été utilisés au cours de la dernière décennie. Des progiciels dédiés, tels que AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS et EPU, ont été développés pour l’acquisition automatisée de données.
Ces progiciels utilisent des tâches de routine pour trouver automatiquement les positions des trous en corrélant les images à faible grossissement aux images à fort grossissement, ce qui aide à identifier les trous avec de la glace vitreuse d’épaisseur de glace appropriée pour l’acquisition d’images dans des conditions à faible dose. Ces progiciels ont permis de réduire le nombre de tâches répétitives et d’augmenter le débit de la collecte de données cryo-EM en acquérant une grande quantité de données de bonne qualité pendant plusieurs jours en continu, sans aucune interruption et sans la présence physique de l’opérateur. Latitude-S est un progiciel similaire, utilisé pour l’acquisition automatique de données pour l’analyse d’une seule particule. Cependant, ce progiciel ne convient qu’aux DED K2/K3 et est fourni avec ces détecteurs.
Ce protocole démontre le potentiel de Latitude-S dans l’acquisition automatisée d’images de la protéine de pointe SARS-CoV-2 avec un détecteur d’électrons direct équipé d’un cryo-EM de 200 keV (voir le Tableau des matériaux). À l’aide de cet outil de collecte de données, 3 000 fichiers vidéo de la protéine de pointe du SARS-CoV-2 sont automatiquement acquis et un traitement ultérieur des données est effectué pour obtenir une structure protéique de pointe de résolution 3,9-4,4 Å.
Protocol
Representative Results
Discussion
Latitude-S est une interface utilisateur intuitive qui fournit un environnement permettant de configurer et de collecter automatiquement des milliers de micrographies haute résolution ou de fichiers vidéo en deux jours. Il permet une navigation facile à travers les grilles et maintient la position de l’étage du microscope tout en passant d’un faible grossissement à un grossissement élevé. Chaque étape de l’acquisition de données avec Latitude-S est rapide, avec des fonctionnalités telles qu’une interfac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Département de biotechnologie, le Département des sciences et de la technologie (DST) et des Sciences, et le Ministère du développement des ressources humaines (MHRD), Inde, pour le financement et l’installation cryo-EM à IISc-Bangalore. Nous reconnaissons le programme DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) et DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) pour l’installation nationale de Cryo-EM à IISc, Bangalore. Nous reconnaissons le soutien financier du Conseil de la recherche en sciences et en génie (SERB) (subvention n° SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 et SERB-IPA/2020/000094), DBT (subvention n° 2020/000094), DBT (grant no. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Nous remercions Mme Ishika Pramanick d’avoir préparé les grilles cryo-EM, la collecte de données cryo-EM et la préparation de la table des matériaux. Nous remercions également M. Suman Mishra pour le traitement d’image cryo-EM et pour nous avoir aidés à préparer les chiffres. Nous remercions le professeur Raghavan Varadarajan de nous avoir aidés à obtenir l’échantillon de protéine de pointe purifié pour cette étude.
Materials
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
Riferimenti
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