Benutzerfreundliche Datenerfassungssoftware mit hohem Durchsatz und vollautomatischer Datenerfassung für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie

Einzelpartikel-Kryo-EM hat sich zu einer gängigen strukturbiologischen Technik zur hochauflösenden Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle ^entwickelt1. Die Einzelpartikelrekonstruktion hängt von der Aufnahme einer großen Anzahl von Mikroaufnahmen von verglasten Proben ab, um zweidimensionale (2D) Partikelbilder zu extrahieren, die dann verwendet werden, um eine dreidimensionale (3D) Struktur eines biologischen Makromoleküls zu ^{rekonstruieren2,3}. Vor der Entwicklung von DEDs lag die durch die Einzelpartikelrekonstruktion erreichte Auflösung zwischen 4 und 30 ^Å4,5. Vor kurzem hat die erreichbare Auflösung von Einzelpartikel-Kryo-EM mehr als 1,8 ^Å6 erreicht. DED und automatisierte Datenerfassungssoftware haben wesentlich zu dieser Auflösungsrevolution ^beigetragen7, bei der menschliche Eingriffe zur Datenerfassung minimal sind. Im Allgemeinen wird die Kryo-EM-Bildgebung bei niedrigen Elektronendosisraten (20-100 e/^Å2) durchgeführt, um die durch Elektronenstrahle induzierte Strahlenschädigung biologischer Proben zu minimieren, was zu dem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Bild beiträgt. Diese niedrige SNR behindert die Charakterisierung der hochauflösenden Strukturen biologischer Makromoleküle mittels Einzelpartikelanalyse.

Die Elektronendetektoren der neuen Generation sind CMOS-basierte Detektoren (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor), die diese niedrigen SNR-bezogenen Hindernisse überwinden können. Diese CMOS-Kameras mit direkter Detektion ermöglichen ein schnelles Auslesen des Signals, wodurch die Kamera eine bessere Punktspreizungsfunktion, ein geeignetes SNR und eine hervorragende Detektivquanteneffizienz (DQE) für biologische Makromoleküle beiträgt. Direktdetektionskameras bieten ein hohes SNR8 und ein geringes Rauschen in den aufgenommenen Bildern, was zu einer quantitativen Steigerung der Detektivquanteneffizienz (DQE) führt – ein Maß dafür, wie viel Rauschen ein Detektor zu einem Bild hinzufügt. Diese Kameras zeichnen auch Filme mit einer Geschwindigkeit von Hunderten von Bildern pro Sekunde auf, was eine schnelle Datenerfassung ^{ermöglicht9,10}. All diese Eigenschaften machen schnelle Direktdetektionskameras für anwendungen mit niedriger Dosis geeignet.

Bewegungskorrigierte Stapelbilder werden für die Datenverarbeitung verwendet, um die 2D-Klassifizierung zu berechnen und eine 3D-Dichtekarte von Makromolekülen mit verschiedenen Softwarepaketen wie ^RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, ^cisTEM14 und ^EMAN215 zu rekonstruieren. Für die Einzelpartikelanalyse ist jedoch ein enormer Datensatz erforderlich, um eine hochauflösende Struktur zu erreichen. Daher sind automatische Datenerfassungsmauten für die Datenerfassung von großer Bedeutung. Um große Kryo-EM-Datensätze zu erfassen, wurden in den letzten zehn Jahren mehrere Softwarepakete verwendet. Dedizierte Softwarepakete wie ^AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, ^SerialEM19, UCSF-Image420, ^TOM221, ^SAM22, ^JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS und EPU wurden für die automatisierte Datenerfassung entwickelt.

Diese Softwarepakete verwenden Routineaufgaben, um Bohrungspositionen automatisch zu finden, indem sie die Bilder mit geringer Vergrößerung mit Bildern mit hoher Vergrößerung korrelieren, was bei der Identifizierung von Löchern mit glasigem Eis von geeigneter Eisdicke für die Bildaufnahme unter niedrig dosierten Bedingungen hilft. Diese Softwarepakete haben die Anzahl der sich wiederholenden Aufgaben reduziert und den Durchsatz der Kryo-EM-Datenerfassung erhöht, indem sie mehrere Tage lang kontinuierlich eine große Menge an qualitativ hochwertigen Daten ohne Unterbrechung und die physische Anwesenheit des Bedieners erfasst haben. Latitude-S ist ein ähnliches Softwarepaket, das zur automatischen Datenerfassung für die Einzelpartikelanalyse verwendet wird. Dieses Softwarepaket ist jedoch nur für K2/K3-DEDs geeignet und wird mit diesen Detektoren ausgeliefert.

Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial von Latitude-S bei der automatisierten Bilderfassung des SARS-CoV-2-Spikeproteins mit einem direkten Elektronendetektor, der mit einem 200 keV Kryo-EM ausgestattet ist (siehe Materialtabelle). Mit diesem Datenerfassungstool werden automatisch 3.000 Filmdateien des SARS-CoV-2-Spike-Proteins erfasst und eine weitere Datenverarbeitung durchgeführt, um eine Spike-Proteinstruktur mit einer Auflösung von 3,9-4,4 Å zu erhalten.