Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

La modellazione della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) in laboratorio è resa particolarmente impegnativa a causa della natura estremamente sporadica di oltre l’80% dei ^casi1, insieme al vasto numero di mutazioni genetiche note per essere causative della ^malattia2. Nonostante ciò, tutti i casi di SLA condividono la caratteristica unificante che prima della degenerazione neuronale vera e propria, esiste una comunicazione disfunzionale tra motoneuroni presinaptici e cellule muscolari postsinaptiche3,4. Clinicamente, poiché i pazienti perdono la connettività dei restanti motoneuroni superiori e inferiori, presentano caratteristiche di iper- e ipoeccitabilità neuronale in tutta la malattia5,6,7,8,9, riflettendo complessi cambiamenti molecolari sottostanti a queste sinapsi, che noi, come ricercatori della SLA, cerchiamo di capire.

Molteplici modelli transgenici hanno dimostrato che il deterioramento e la disorganizzazione della giunzione neuromuscolare si verificano con l’espressione di mutazioni genetiche causative della SLA, tra cui ^SOD110, ^FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 e TDP4317,18,19 attraverso valutazioni morfologiche, compresa la valutazione dei bouton sinaptici, delle densità della colonna vertebrale e dell’organizzazione pre/postsinaptica. Meccanicamente, a partire dai documenti di riferimento di Cole, Hodgkin e Huxley nel 1930, è stato anche possibile valutare le risposte sinaptiche attraverso tecniche elettrofisiologiche in colture cellulari in vitro o preparazioni di fette di ^tessuto20. Attraverso queste strategie, molti modelli di SLA hanno dimostrato deficit di trasmissione sinaptica. Ad esempio, una variante mutante di TDP43 provoca una maggiore frequenza di attivazione e diminuisce la soglia del potenziale d’azione nelle cellule simili a motoneuroni NSC-34 (midollo spinale x neuroblastoma ibrido linea 34)²¹. Questa stessa variante causa anche la trasmissione sinaptica disfunzionale alla giunzione neuromuscolare (NMJ) prima dell’insorgenza di deficit motori comportamentali in un modello ^murino22. In precedenza è stato dimostrato che l’espressione di FUS mutante provoca una ridotta trasmissione sinaptica all’NMJ in un modello di drosophila di FUS-ALS prima dei difetti ^locomotori11. Un recente rapporto che utilizza cellule staminali pluripotenti indotte derivate da portatori di espansione C9orf72 ha rivelato una riduzione del pool prontamente rilasciabile di vescicole ^sinaptiche23. Complessivamente, questi studi e altri evidenziano l’importanza di costruire una comprensione più completa dei meccanismi alla base della segnalazione sinaptica nei modelli rilevanti per la malattia della SLA. Questo sarà fondamentale per comprendere la patobiologia della SLA e sviluppare potenziali bersagli terapeutici per i pazienti.

I metodi delle celle di serraggio di corrente e tensione sono stati preziosi nel determinare le proprietà della membrana come la conduttanza, il potenziale di membrana a riposo e il contenuto quantico delle singole ^sinapsi20,24. Tuttavia, uno dei limiti significativi dell’elettrofisiologia è che è tecnicamente impegnativo e fornisce solo approfondimenti da un singolo neurone alla volta. La microscopia confocale a cellule vive, accoppiata con specifiche sonde fluorescenti, offre l’opportunità di indagare la trasmissione sinaptica dei neuroni in modo spaziotemporale25,26,27. Sebbene non sia una misura diretta dell’eccitabilità neuronale, questo approccio di fluorescenza può fornire una misura relativa di due correlazioni molecolari della funzione sinaptica: rilascio di vescicole sinaptiche e transienti di calcio ai terminali sinaptici.

Quando un potenziale d’azione raggiunge la regione terminale presinaptica dei neuroni, si innescano transitori di calcio, facilitando la transizione da un segnale elettrico al processo di rilascio di neurotrasmettitori28. I canali del calcio voltaggio-dipendenti localizzati in queste aree regolano strettamente la segnalazione del calcio per modulare la cinetica del rilascio dei neurotrasmettitori29. Le prime registrazioni riportate a fluorescenza di transienti di calcio sono state eseguite utilizzando l’indicatore a doppia lunghezza d’onda Fura-2 AM o il colorante a singola lunghezza d’onda Fluo-3 AM30,31,32. Mentre questi coloranti offrivano grandi nuove intuizioni all’epoca, soffrono di diverse limitazioni come la compartimentazione non specifica all’interno delle cellule, la perdita di colorante attiva o passiva dalle cellule etichettate, il fotosbiancamento e la tossicità se ripresi per lunghi periodi di ^tempo33. Negli ultimi dieci anni, gli indicatori di calcio geneticamente codificati sono diventati i cavalli di battaglia per l’imaging di varie forme di attività neuronale. Questi indicatori combinano una proteina fluorescente modificata con una proteina chelante di calcio che cambia rapidamente l’intensità di fluorescenza dopo il legame degli ioni ^Ca2+34. L’applicazione di questi nuovi indicatori è vasta, consentendo una visualizzazione molto più semplice dei transitori intracellulari di calcio sia in vitro che in vivo. Una famiglia di questi reporter geneticamente codificati, nota come GCaMP, è ora ampiamente utilizzata. Questi indicatori contengono un dominio calmodulina C-terminale, seguito da una proteina fluorescente verde (GFP), e sono coperti da una regione di legame con la calmodulina ^{N-terminale35,36}. Il legame del calcio al dominio calmodulina innesca un’interazione con la regione di legame con la calmodulina, con conseguente cambiamento conformazionale nella struttura complessiva della proteina e un sostanziale aumento della fluorescenza della porzione ^GFP35,36. Nel corso degli anni, questa famiglia di reporter ha subito diverse evoluzioni per consentire letture distinte per particolari transienti di calcio con cinetica specifica (lenta, media e veloce), ognuno con proprietà leggermente ^diverse37,38. Qui, è stato evidenziato l’uso del reporter GcaMP6, che ha precedentemente dimostrato di rilevare potenziali d’azione singoli e transitori di calcio dendritico nei neuroni sia in vivo che di ^vitro37.

I transienti di calcio nella regione presinaptica innescano eventi di fusione delle vescicole sinaptiche, causando il rilascio di neurotrasmettitori nella sinapsi e l’inizio di eventi di segnalazione nella cellula postsinaptica28,39. Le vescicole sinaptiche vengono rilasciate rapidamente e riciclate, poiché la cellula mantiene omeostaticamente una superficie di membrana cellulare stabile e un pool prontamente rilasciabile di vescicole legate alla membrana in grado di ^fusione40. Il colorante stirilico qui utilizzato ha un’affinità verso le membrane lipidiche e cambia specificamente le sue proprietà di emissione in base all’ordinamento dell’ambiente lipidico ^{circostante41,42}. Pertanto, è uno strumento ideale per etichettare le vescicole sinaptiche di riciclaggio e il successivo tracciamento di queste vescicole in seguito alla stimolazione ^{neuronale41,42}. Il protocollo che è stato generato e ottimizzato è un adattamento dei concetti descritti inizialmente da Gaffield e colleghi, che ci consente di visualizzare continuamente la puntura di vescicole sinaptiche marcate con colorante stirilico nel ^tempo41.

Qui vengono descritte due metodologie correlate basate sulla fluorescenza, che riportano in modo affidabile eventi cellulari specifici coinvolti nella trasmissione sinaptica. Sono stati definiti protocolli per sondare la dinamica dell’afflusso terminale di calcio presinaptico mediato dalla depolarizzazione e dell’esocitosi delle vescicole sinaptiche nei neuroni in coltura. Qui, i metodi e i risultati rappresentativi si concentrano sull’uso di neuroni corticali o motoneuroni primari dei roditori come sistema modello in vitro, poiché ci sono studi pubblicati che utilizzano questi tipi di ^cellule43,44. Tuttavia, questi metodi sono applicabili anche ai neuroni corticali ⁱ³ umani ^{differenziati45}, poiché abbiamo anche avuto successo con entrambi i protocolli nella sperimentazione attualmente in corso nel nostro laboratorio. Il protocollo generale è delineato in un formato lineare graduale, mostrato nella Figura 1. In breve, per studiare la dinamica del calcio nei neuriti, i neuroni maturi vengono trasfettati con DNA plasmidico per esprimere il reporter fluorescente GCaMP6m sotto un promotore del citomegalovirus (CMV)^37,46. Le cellule trasfettate hanno un basso livello di fluorescenza verde basale, che aumenta in presenza di calcio. Le regioni di interesse sono specificate per monitorare i cambiamenti di fluorescenza durante la nostra manipolazione. Ciò consente di misurare fluttuazioni del calcio altamente localizzate spazialmente e ^{temporalmente37,46}. Per valutare la fusione e il rilascio delle vescicole sinaptiche, i neuroni maturi vengono caricati con colorante stirilico incorporato nelle membrane delle vescicole sinaptiche mentre vengono riciclati, riformati e ricaricati con neurotrasmettitori nelle cellule presinaptiche41,42,43,47,48. Gli attuali coloranti utilizzati a questo scopo etichettano le vescicole sinaptiche lungo i neuriti e sono usati come proxy per queste regioni in esperimenti di imaging dal vivo, come è stato dimostrato dalla co-colorazione del colorante stirilico e della sinaptotagmina di Kraszewski e ^colleghi49. Qui sono incluse immagini rappresentative di colorazioni simili che sono state eseguite (Figura 2A). Precedenti ricercatori hanno ampiamente utilizzato tali coloranti per riportare la dinamica delle vescicole sinaptiche alla giunzione neuromuscolare e ai neuroni dell’ippocampo48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Selezionando regioni puntiformi di vescicole cariche di colorante e monitorando le diminuzioni dell’intensità di fluorescenza dopo il rilascio delle vescicole, la capacità di trasmissione sinaptica funzionale e la dinamica temporale di rilascio possono essere studiate dopo la ^{stimolazione43}. Per entrambi i metodi, un mezzo contenente un’alta concentrazione di cloruro di potassio viene impiegato per depolarizzare le cellule per imitare l’attività neuronale. I parametri di imaging sono specificati per catturare intervalli inferiori al secondo che coprono una normalizzazione di base seguita dal nostro periodo di cattura della stimolazione. Le misure di fluorescenza in ogni punto temporale sono determinate, normalizzate sullo sfondo e quantificate nel periodo di tempo sperimentale. L’aumento della fluorescenza GCaMP6m mediato dall’afflusso di calcio o l’efficace diminuzione della fluorescenza dell’esocitosi delle vescicole sinaptiche styryl dye release può essere rilevata attraverso questa strategia. Di seguito sono descritti la configurazione metodologica dettagliata e i parametri per questi due protocolli e una discussione sui loro vantaggi e limiti.

Figura 1: Rendering visivo del processo generale del protocollo generale. (1) Isolare e coltivare i neuroni primari dei roditori in vitro fino al punto temporale di maturazione scelto. (2) Introdurre il DNA GCaMP o il colorante stirilico come reporter dell’attività sinaptica. (3) Impostare il paradigma di imaging utilizzando il microscopio confocale dotato di live-imaging e il software associato. Inizia il periodo di registrazione di base. (4) Mentre le cellule sono ancora in fase di acquisizione di immagini dal vivo, stimolare i neuroni attraverso un’elevata perfusione del bagno KCl. (5) Valutare le misurazioni dell’intensità di fluorescenza nel tempo per misurare i transitori di calcio o la fusione delle vescicole sinaptiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.