Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

1. Zusammenbau und Verwendung des Transplantationsgeräts Montage des Transplantationsgeräts. Schließen Sie die gasdichte 25-μL-Spritze mit Luer-Spitze und einen Mikropipettenhalter mit Luer-Verriegelung an, um das Transplantationsgerät zusammenzubauen (Abbildung 1A).HINWEIS: Die Benetzung der Luer-Spitze mit einem dünnen Wasserfilm kann dazu beitragen, die Verbindung zu verbessern, indem die Teile über Wasseradhäsion und Kohäsion zusammengehalten werden. Montieren Sie das Gerät direkt auf einem manuellen Mikromanipulator (Abbildung 1B). Das Gerät kann allein mit der dominanten Hand gesteuert werden, wodurch die andere Hand für zusätzliche Aufgaben frei wird. Vorbereitung der Transplantationsnadel. Erzeugen Sie eine Transplantationsnadel, indem Sie eine Glaskapillarpipette (ohne Filament) mit einem Mikropipettenzieher ziehen. Brechen Sie die Nadelspitze so glatt wie möglich, da scharfe Kanten die Wahrscheinlichkeit erhöhen, das Eigelb während der Transplantation zu zerkratzen, was für den Embryo tödlich ist.HINWEIS: Die Spitze kann leicht mit einer Rasierklinge mit gerader Schneide unter einem Stereomikroskop gebrochen werden. Die Verwendung einer Mikroschmiede ermöglicht es jedoch, eine präzise Öffnung der gewünschten Größe zu erzeugen. Für die Erzeugung ektopischer Quellen ist ein Außendurchmesser von ca. 50-60 μm geeignet. Bei Extipationen und Keimbahntransplantationen sollte der Außendurchmesser der Nadel etwa 80-90 μm betragen, um die Anzahl der transplantierten Zellen zu erhöhen. Führen Sie die gebrauchsfertige Nadel in das Transplantationsgerät ein (Abbildung 1A). Verwendung des Transplantationsgeräts.Platzieren Sie den Mikromanipulator mit dem Transplantationsgerät neben einem Stereomikroskop (Abbildung 1B). Entfernen Sie den Kolben und senken Sie die Transplantationsnadel in der mit Ringers Lösung gefüllten Transplantationsschale (siehe Schritt 2.2.1) in einem Winkel von 45°, bis die Nadelspitze eingetaucht ist (Abbildung 1B). Wasser wird die Nadel aufgrund der Kapillarwirkung hochstürzen. Führen Sie den Kolben ungefähr zur Hälfte ein, um die Lösungen des Ringers auszuspülen, und lassen Sie nur ein kleines Wasservolumen in dem dünnen, sich verjüngenden Teil der Nadel zurück (Abbildung 1C).HINWEIS: Dies ist die neutrale Position, und der Wasserstand sollte dort für eine Weile stabil sein (>20 min). Wenn der Wasserstand instabil ist, tritt die Luft aus; Schließen Sie die Luer-Verriegelung wieder an, oder ersetzen Sie die Spritze. Wenn Sie zum ersten Mal eine Transplantationsnadel verwenden, beschichten Sie ihr Inneres, indem Sie Eigelb aus einem geopferten Embryo ziehen und dann das Eigelbmaterial vollständig ausstoßen. Die Beschichtung wird dazu beitragen, die Haftung der Zellen auf dem Glas bei nachfolgenden Verfahren zu reduzieren. Positionieren Sie den Spenderembryo vorsichtig mit Hilfe der Nadel und positionieren Sie dann die Nadelöffnung orthogonal zur Oberfläche des Embryos (Abbildung 1D).HINWEIS: Die Position ist für verschiedene Assays unterschiedlich. Für die Erzeugung ektopischer Signalmolekülquellen und Zellexpretionen wird dies die Oberseite des Tierpols sein (Abbildung 1E); bei der Keimbahntransplantation ist dies der Rand (Abbildung 1D,F). Ziehen Sie langsam und vorsichtig den Kolben hoch, um die Zellen in die Nadel zu ziehen.HINWEIS: Wenn die Zellen zu schnell aufgenommen werden, können sie beschädigt werden. Wenn es richtig gemacht wird, sollten die Zellen als zylindrische Säule herauskommen. Vermeiden Sie es, Eigelb in die Nadel aufzunehmen, da das transplantierte Eigelb für den Wirtsembryo toxisch ist. Stoppen Sie die Absaugung, indem Sie den Kolben vorsichtig leicht nach unten drücken, sobald die gewünschte Anzahl von Zellen eingezogen ist. Entfernen Sie die Nadel vom Embryo, indem Sie die Nadel in einer kurzen und schnellen Bewegung zur Seite ziehen. Lassen Sie etwas Ringer-Lösung auf beiden Seiten der Zellsäule und beschränken Sie die Zellen auf das sich verjüngende Ende der Nadel (Abbildung 1C,D).HINWEIS: Die Flüssigkeit vor der Zellsäule hilft, die Zellen der Wirtsembryonen bei der Ablagerung der Zellsäule auseinanderzudrücken. Entfernen Sie das verbleibende Eigelb oder Zelltrümmer, indem Sie den Kolben langsam auf und ab bewegen – während die Nadel eingetaucht bleibt -, um die Zellen mit Ringers Lösung zu waschen. Wenn es richtig gemacht wird, bleiben die unbeschädigten Zellen in einer Säule zusammengeklebt, während die Trümmer weggespült werden.HINWEIS: Bei diesem Schritt ist große Vorsicht geboten, da der Wasserstand über das sich verjüngende Ende der Nadel hinaus ansteigt. Dies führt zu einem plötzlichen Zustrom von Wasser, das zum Waschen der Zellen verwendet werden kann. Sobald der Wasserstand jedoch das sich verjüngende Ende passiert hat, wird die Feinkontrolle mit dem Kolben reduziert und der Kolben muss langsamer und vorsichtiger bewegt werden. Bewegen Sie die Transplantationsschale mit der nicht dominanten Hand, um die Nadel orthogonal zur Oberfläche (entweder Tierpol oder Rand) des Wirtsembryo zu positionieren (Abbildung 1D-F). Üben Sie vorsichtig leichten Druck aus und geben Sie dann eine schnelle, scharfe Bewegung, um die umhüllende Schicht des Wirtsembryo zu durchbohren. Achten Sie darauf, das Eigelb nicht mit der Nadel zu zerkratzen.HINWEIS: Die Anwendung von leichtem Druck auf den Embryo durch vorsichtiges Drücken gegen die Wände des Brunnens erhöht die Oberflächenspannung des Embryos und erleichtert so das Durchstechen der umhüllenden Schicht. Sobald sich die Nadel im Inneren befindet, drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellsäule in den Embryo zu extrudieren, während Sie gleichzeitig die Nadel langsam zurückziehen (Abbildung 1D-F). Reinigen der Transplantationsnadel. Spülen Sie die Nadel aus, indem Sie den Kolben auf und ab bewegen, während die Nadel in deionisiertes Wasser eingetaucht wird.HINWEIS: Wenn die Nadel schmutzig bleibt, spülen Sie sie mit 10 M Natronlauge ab, bevor Sie sie erneut mit Wasser abspülen. Bewahren Sie die Nadel zur weiteren Verwendung in einer geeigneten Box auf. 2. Erzeugung ektopischer Quellen von sezernierten Signalmolekülen in Zebrafischembryonen Vorbereitung der Wirts- und Spenderembryonen. Sammeln Sie frisch gelegte Embryonen, indem Sie Zebrafische paaren. Dechorionieren Sie Zebrafischembryonen im 1-Zell-Stadium, indem Sie bis zu 100 Embryonen in 0,5 mg/ ml Pronaselösung für ca. 15 min in einer kleinen Glas-Petrischale inkubieren (eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens wurde von Rogers, K. W. et al.14 veröffentlicht).HINWEIS: Alternativ können die Embryonen auch kurz vor der Transplantation im hohen Stadium dehorioniert werden (Schritt 2.2), dies erfordert jedoch, dass die injizierten Spenderembryonen und die nicht injizierten Wirtsembryonen separat dehorioniert werden. Tauchen Sie die Embryonen in embryonales Medium in ein 200 ml Becherglas.HINWEIS: Dekahorionierte Blastula- und Gastrula-Stadiumsembryonen sind sehr empfindlich. Ihr freiliegendes Eigelb haftet auf Kunststoffoberflächen und reißt bei Kontakt mit Luft. Daher müssen sie vollständig in das Embryomedium eingetaucht bleiben, mit einem Glaspipette übertragen und entweder in Agarose-beschichteten (1% im Embryomedium) Kunststoffschalen oder In Petrischalen aus Glas gehalten werden. Leeren Sie vorsichtig den größten Teil des Embryomediums und füllen Sie das Becherglas langsam mit frischem Embryomedium. Die auf diese Weise verursachte leichte Erregung erleichtert die Entfernung der geschwächten Chorionen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2-3 Mal. Übertragen Sie die dekumentierten Embryonen mit einer Pasteurpipette aus Glas in eine mit Agarose beschichtete Injektionsschale.HINWEIS: Das Entflammen der Spitze der Pasteurpipette des Glases durch Aussetzen einer Bunsenbrennerflamme kann schmelzen und den Rand glätten, um Schäden an den Embryonen zu vermeiden. Injizieren Sie die mRNA, die für das fluoreszenzmarkierte Protein kodiert, in eine Untergruppe von Embryonen (eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens wurde von Rogers, K. W. et al.14 veröffentlicht). Injizieren Sie die mRNA in die Zelle, nicht das Eigelb, für eine nahezu homogene Expression. Injizierte Embryonen dienen als Spender, während nicht injizierte Embryonen als Wirte dienen.HINWEIS: Die Menge und Art der injizierten mRNA hängt von dem untersuchten Signalmolekül ab und liegt normalerweise zwischen 20 und 200 pg2,4,5,6 (kann aber in bestimmten Fällen bis zu 1000 pg betragen4). Übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine mit Agarose beschichtete Sechs-Well-Schale, die mit Embryomedium gefüllt ist. Bei 28 °C inkubieren, bis die Embryonen das frühe Kugelstadium erreicht haben. Transplantation von Zellen, um ektopische Quellen zu erzeugen. Füllen Sie eine Transplantationsschale (mit einzelnen dreieckigen keilförmigen Vertiefungen, siehe Materialtabelle) mit Ringers Lösung (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; lagern Sie den HEPES-Puffer bei 4 °C).HINWEIS: Das Kalzium in Ringers Lösung fördert die Zelladhäsion und hilft dem Embryo, von der Transplantation zu heilen. Übertragen Sie die Embryonen in die Transplantationsschale. Positionieren Sie den Wirts- und Spenderembryonen in abwechselnden Säulen, jeweils mit der Tierstange, die auf die Transplantationsnadel ausgerichtet ist. Führen Sie die Transplantation wie in Abschnitt 1.3 beschrieben durch. Für die ektopische Quellentransplantation nehmen Sie Quellzellen von der Oberseite des Tierpols und deponieren sie an derselben Stelle im Wirtsembryo (Abbildung 1E).HINWEIS: Das Waschen der Zellen mit Ringers Lösung, wie in Schritt 1.3.8 beschrieben, ist wichtig für die Erzeugung ektopischer Quellen, um sicherzustellen, dass bereits sezernierte Signalmoleküle nicht auf den Wirt übertragen werden. Transplantieren Sie nicht zu viele Zellen, um sicherzustellen, dass die Quelle nicht dispergiert ist. Eine Säule mit einem Durchmesser von ca. 80 μm und einer Länge von 100 μm eignet sich für viele Anwendungen. Lassen Sie den Wirtsembryo 30 Minuten bis 1 h in Ringers Lösung bleiben, um sich zu erholen. Untersuchen Sie, ob Zellen mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop erfolgreich transplantiert wurden (Abbildung 2). Nach der Genesung werden die Embryonen auf eine mit Agarose beschichtete Sechs-Well-Platte übertragen, die mit Embryomedium gefüllt ist, und bei 28 °C inkubiert. 3. Erzeugung größenreduzierter Embryonen durch Zellexkretion Vorbereitung der Embryonen für die Ausrottung. Sammeln Sie frisch gelegte Embryonen von Zebrafischen des gewünschten Genotyps. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28 °C, bis sie das hohe Stadium erreichen. Dekreionieren Sie die Embryonen wie in den Schritten 2.1.2-2.1.5 beschrieben, wenn die Embryonen das hohe Stadium erreichen.HINWEIS: In diesem Beispiel wird die Zellerregung in der Kugelstufe durchgeführt. Dementsprechend werden Embryonen etwa 30 min bis 1 h früher dehorioniert. Optional: Beschriftung der Eigelb-Synzytialschicht (YSL).HINWEIS: Falls gewünscht, injizieren Sie fluoreszierendes Dextrans in das YSL, bevor Sie zellen ausrotten. Mit dieser Technik kann festgestellt werden, ob das YSL nach der Zellentfernung intakt bleibt, was für die normale Embryogenese wichtig ist15. Alternativ können auch in vitro synthetisierte mRNAs oder Proteine in das YSL injiziert werden. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die dekumentierten Embryonen in eine mit Agarose beschichtete Injektionsschale zu übertragen, die mit Embryonenwasser gefüllt ist. Richten Sie die Embryonen seitlich aus, wobei der Blastodermenrand auf die Injektionsnadel zeigt (Abbildung 3A). Injizieren Sie 0,5 nL von 1,5 μg / μL 10 kDa Alexa568-Dextran in das YSL und zielen Sie auf einen Bereich zwischen den Blastodermzellen und dem Eigelb in einer Tiefe von etwa einem Drittel des Embryodurchmessers ab. Injizieren Sie alle Embryonen innerhalb einer Reihe.HINWEIS: Da die Injektionsnadel nicht durch das Chorion durchbohren muss, ist eine kleine (~4 μm) und scharfe Öffnung von Vorteil. Drehen Sie die Embryonen um 180°, so dass die gegenüberliegende Seite des Blastodermenrands auf die Injektionsnadel zeigt (Abbildung 3A). Injizieren Sie weitere 0,5 nL 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran in das YSL, wie in Schritt 3.2.3 beschrieben, was ein Gesamteinjektionsvolumen von 1 nL pro Embryo ergibt.HINWEIS: Die Injektion von zwei Seiten ermöglicht eine gleichmäßigere Verteilung des fluoreszierenden Dextrans innerhalb des YSL. Untersuchen Sie das Ergebnis der Injektion unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Wenn es richtig gemacht wird, wird das Fluoreszenzsignal auf das YSL beschränkt (Abbildung 3B) und ist im Interzellularraum des Blastoderms nicht sichtbar. Zellen ausrotten Füllen Sie eine Transplantationsschale mit Ringer-Lösung (siehe Schritt 2.2.1). Übertragen Sie die Embryonen in die Transplantationsschale. Richten Sie die Embryonen mit dem Tierpol auf die Transplantationsnadel aus (Abbildung 3C). Entfernen Sie vorsichtig Zellen aus der tierischen Polregion, wie in den Schritten 1.3.5-1.3.7 beschrieben, wodurch das Blastoderm auf die gewünschte Größe reduziert wird. Verwerfen Sie die entfernten Zellen, indem Sie sie aus der Transplantationsnadel ausstoßen. Sobald der Eingriff abgeschlossen ist, lassen Sie die Embryonen 30 Minuten bis 1 h in Ringers Lösung bleiben, um sich zu erholen. OPTIONAL: Untersuchen Sie die Integrität des YSL unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop (Abbildung 3D). Die Embryonen werden auf eine mit Embryonenmedium gefüllte, mit Agarose beschichtete Platte überführt und bei 28 °C inkubiert. 4. Erzeugung mütterlich-zygotischer Mutanten durch Keimbahntransplantation Vorbereitung von Wirts- und Spenderembryonen. Sammeln Sie frisch gelegte Embryonen von mutierten und Wildtyp-Zebrafischen. Embryonen von Zebrafischen mit mutiertem Hintergrund dienen als Spender, während Embryonen von Zebrafischen mit Wildtyphintergrund als Wirte dienen.HINWEIS: Die Keimbahntransplantation erfordert eine hohe Anzahl von Startembryonen (~ 50 für Spender, ~ 500 für Wirte), um eine gute Anzahl erfolgreicher Keimbahntransplantationen zu gewährleisten, die bis ins Erwachsenenalter überleben. Überführen Sie die Embryonen mit einer Pasteurpipette in eine mit Agarose beschichtete Injektionsschale mit Embryomedium.HINWEIS: Injektionen werden vor der Dekationierung durchgeführt, um den Durchsatz zu erhöhen. Nadeln für die Injektion durch das Chorion müssen stumpf sein und eine größere Öffnung (~ 10 μm) haben, um ein Verstopfen zu verhindern. Injizieren Sie den Spenderembryonen 1 nL 100 ng/μL mRNA, die für GFP kodiert, mit einer Nos1 3’UTR. Injizieren Sie die mRNA in das Eigelb, um den Durchsatz zu erhöhen.HINWEIS: Die Nos1 3’UTR stabilisiert die mRNA in den primordialen Keimzellen, wodurch die Keimzellen 1 Tag nach der Befruchtung stark fluoreszierend sind10. Injizieren Sie den Wirtsembryonen 1 nL 0,33 mM (3 μg/μL) Sackgasse (dnd) Morpholino. Injizieren Sie das Morpholino in das Eigelb, um den Durchsatz zu erhöhen.HINWEIS: Der dnd morpholino blockiert die primordiale Keimzellbildung, wodurch sichergestellt wird, dass die Keimbahn des Wirtsembryo nach der Transplantation ausschließlich mit Zellen des Spenders besiedelt wird10. Übertragen Sie die injizierten Embryonen mit Embryomedium in Plastik-Petrischalen. Bei 28 °C inkubieren, bis die Embryonen das hohe Stadium erreicht haben. Dekreionieren Sie die Embryonen wie in den Schritten 2.1.2-2.1.5 beschrieben, wenn die Embryonen das hohe Stadium erreichen. Transplantation von Keimzellen Füllen Sie eine Transplantationsschale mit Ringer-Lösung (siehe Schritt 2.2.1). Übertragen Sie die dekumentierten Kugel- bis Kuppelstadium-Embryonen in die Transplantationsschale. Positionieren Sie die Wirtsembryonen und Spenderembryonen in abwechselnden Säulen, um die Zellen von einem Spenderembryo auf sechs verschiedene Wirtembryonen zu transplantieren. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Keimzellen aus einem bestimmten Wirtsembryo erfolgreich transplantiert werden. Richten Sie die Embryonen mit dem Rand auf die Transplantationsnadel aus und führen Sie die Transplantation wie in Abschnitt 1.3 beschrieben durch. Für Keimbahntransplantationen (Abbildung 1D,F) nehmen Sie die Quellzellen vom Rand (wo sich die primordialen Keimzellen befinden) und deponieren Sie sie an derselben Stelle im Wirtsembryo.HINWEIS: Das Umpflanzen einer großen Säule (ca. 80 μm Durchmesser und 600 μm Länge) erhöht die Chance auf eine erfolgreiche Keimbahntransplantation. Lassen Sie den Embryo 30 Minuten bis 1 h in Ringers Lösung bleiben, um sich nach Abschluss der Transplantation zu erholen.HINWEIS: Wenn nicht alle Spenderembryonen homozygote Mutanten sein sollen – z. B. wenn sie aus einer heterozygoten Kreuzung resultieren – müssen sie nach der Transplantation genotypisiert werden, um den Genotyp der transplantierten zukünftigen Keimbahn des Wirts zu bestimmen. Stellen Sie in diesem Fall sicher, dass die Positionen des Wirts und der Spenderembryonen während der Handhabung nicht verwechselt werden. Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Stereomikroskop, um zu untersuchen, ob die Zellen erfolgreich transplantiert wurden (Abbildung 4A,B). Übertragen Sie die Embryonen in eine 24-Well-Agarose-beschichtete Platte. Gruppieren Sie alle Wirtsembryonen, die Zellen von derselben Spenderin erhalten haben, in denselben Brunnen und markieren Sie sie entsprechend. Inkubieren Sie sie bis zum nächsten Tag bei 28 °C. Falls erforderlich, übertragen Sie die Spenderembryonen zur Genotypisierung in markierte PCR-Streifen. Screening auf erfolgreiche Keimbahntransplantationen Screening der Wirtsembryonen auf erfolgreiche Keimbahntransplantationen unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop etwa 30 h nach der Befruchtung (hpf). Die Keimzellen befinden sich an der Rille oberhalb der Dotterverlängerung (Abbildung 4C).HINWEIS: Typische Experimente mit dem hier vorgestellten Gerät und der hier vorgestellten Strategie haben eine Erfolgsrate von ~ 60% -80%, um mindestens einen Wirtsembryo zu erhalten, der transplantierte Keimzellen pro Spenderembryo trägt. Ein früherer Bericht beschrieb einen Wirkungsgrad von ~ 10. Falls zutreffend, entsorgen Sie Embryonen, die Zellen von Spenderembryonen mit einem falschen Genotyp erhalten haben. Züchten Sie Larven mit erfolgreich transplantierten Keimzellen bis ins Erwachsenenalter gemäß den üblichen Haltungsbedingungen und nach institutionellen Richtlinien.