Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

1. Assemblaggio e utilizzo del dispositivo di trapianto Assemblaggio del dispositivo di trapianto. Collegare la siringa a tenuta di gas Luer tip 25 μL e un supporto per micropipette con raccordo Luer lock per assemblare il dispositivo di trapianto (Figura 1A).NOTA: Bagnare la punta Luer con un sottile film d’acqua può aiutare a migliorare la connessione tenendo insieme le parti tramite adesione e coesione dell’acqua. Montare il dispositivo direttamente su un micromanipolatore manuale (Figura 1B). Il dispositivo può essere controllato con la sola mano dominante, liberando l’altra mano per compiti aggiuntivi. Preparazione dell’ago da trapianto. Produrre un ago da trapianto tirando una pipetta capillare di vetro (senza filamento) con un estrattore di micropipette. Rompere la punta dell’ago nel modo più fluido possibile, poiché i bordi taglienti aumentano la possibilità di graffiare il tuorlo durante il trapianto, che è fatale per l’embrione.NOTA: la punta può essere facilmente rotta con una lama di rasoio a bordo dritto sotto uno stereomicroscopio. Tuttavia, l’utilizzo di un microforge consente di generare un’apertura precisa della dimensione desiderata. Per la generazione di sorgenti ectopiche, è appropriato un diametro esterno di circa 50-60 μm. Per le estirpazioni e il trapianto germinale, il diametro esterno dell’ago deve misurare circa 80-90 μm per aumentare il numero di cellule trapiantate. Inserire l’ago pronto all’uso nel dispositivo di trapianto (Figura 1A). Utilizzando il dispositivo di trapianto.Posizionare il micromanipolatore con il dispositivo di trapianto accanto a uno stereomicroscopio (Figura 1B). Rimuovere lo stantuffo e abbassare l’ago da trapianto nella capsula da trapianto riempita con la soluzione di Ringer (vedere punto 2.2.1) con un angolo di 45° fino a quando la punta dell’ago non è immersa (Figura 1B). L’acqua farà scorrere l’ago a causa dell’azione capillare. Inserire lo stantuffo circa a metà strada per scovare le soluzioni del Ringer, lasciando solo un piccolo volume d’acqua nella parte sottile e affusolata dell’ago (Figura 1C).NOTA: Questa è la posizione neutra e il livello dell’acqua dovrebbe essere stabile lì per un po ‘(>20 min). Se il livello dell’acqua è instabile, l’aria perde; ricollegare il raccordo Luer lock o sostituire la siringa. Quando si utilizza un ago da trapianto per la prima volta, rivestirlo all’interno disegnando il tuorlo da un embrione sacrificato e quindi espellendo completamente il materiale del tuorlo. Il rivestimento contribuirà a ridurre l’aderenza delle cellule al vetro durante le procedure successive. Posizionare delicatamente l’embrione donatore con l’aiuto dell’ago e quindi posizionare l’apertura dell’ago ortogonale alla superficie dell’embrione (Figura 1D).NOTA: la posizione sarà diversa per i diversi test. Per la generazione di sorgenti molecolari di segnalazione ectopica ed estirpazioni cellulari, questa sarà la parte superiore del polo animale (Figura 1E); per il trapianto germinale, questo sarà il margine (Figura 1D,F). Lentamente e con attenzione tirare su lo stantuffo per attirare le cellule nell’ago.NOTA: se le cellule vengono prelevate troppo rapidamente, possono essere danneggiate. Se fatto correttamente, le celle dovrebbero uscire come una colonna cilindrica. Evitare di prendere il tuorlo nell’ago, poiché il tuorlo trapiantato è tossico per l’embrione ospite. Arrestare l’aspirazione spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso leggermente una volta che il numero desiderato di celle viene aspirato. Rimuovere l’ago dall’embrione spingendo l’ago di lato con un movimento breve e rapido. Lasciare una soluzione di Ringer su entrambi i lati della colonna cellulare e limitare le cellule all’estremità affusolata dell’ago (Figura 1C,D).NOTA: Il liquido davanti alla colonna cellulare aiuterà a forzare le cellule degli embrioni ospiti durante il deposito della colonna cellulare. Eliminare eventuali tuorli o detriti cellulari rimanenti muovendo lentamente lo stantuffo su e giù – mentre l’ago rimane immerso – per lavare le cellule con la soluzione di Ringer. Se fatto correttamente, le cellule non danneggiate rimarranno aderenti insieme in una colonna mentre i detriti vengono lavati via.NOTA: Durante questa fase è necessario prestare molta attenzione poiché il livello dell’acqua salirà oltre l’estremità affusolata dell’ago. Ciò causerà un improvviso afflusso di acqua, che può essere utilizzata per lavare le cellule. Tuttavia, una volta che il livello dell’acqua ha superato l’estremità affusolata, il controllo fine con lo stantuffo sarà ridotto e lo stantuffo deve essere spostato più lentamente e con attenzione. Spostare la capsula da trapianto con la mano non dominante per posizionare l’ago ortogonale sulla superficie (polo animale o margine) dell’embrione ospite (Figura 1D-F). Applicare delicatamente una leggera pressione, quindi dare un movimento rapido e brusco per perforare lo strato avvolgente dell’embrione ospite. Fare attenzione a non graffiare il tuorlo con l’ago.NOTA: L’applicazione di una leggera pressione sull’embrione schiacciandolo con cura contro le pareti del pozzo aumenta la tensione superficiale dell’embrione e facilita così il piercing dello strato avvolgente. Una volta che l’ago è all’interno, spingere delicatamente lo stantuffo per estrudere la colonna di cellule nell’embrione mentre si ritrae lentamente l’ago allo stesso tempo (Figura 1D-F). Pulizia dell’ago da trapianto. Risciacquare l’ago spostando lo stantuffo su e giù mentre l’ago è immerso in acqua deionizzata.NOTA: Se l’ago rimane sporco, sciacquarlo con 10 M di soluzione di idrossido di sodio prima di risciacquarlo nuovamente con acqua. Conservare l’ago in una scatola appropriata per un ulteriore utilizzo. 2. Generazione di sorgenti ectopiche di molecole di segnalazione secrete in embrioni di zebrafish Preparazione degli embrioni dell’ospite e del donatore. Raccogli embrioni appena deposti accoppiando il pesce zebra. Deciona embrioni di zebrafish allo stadio di 1 cellula incubando fino a 100 embrioni in 0,5 mg/mL di soluzione di pronasi per circa 15 minuti in una piccola capsula di Petri di vetro (una descrizione dettagliata di questa procedura è stata pubblicata da Rogers, K. W. et al.14).NOTA: In alternativa, gli embrioni possono anche essere decorionati nella fase alta appena prima del trapianto (fase 2.2), ma ciò richiede che gli embrioni donatori iniettati e gli embrioni ospiti non iniettati siano decorionati separatamente. Immergere gli embrioni in terreno embrionale in un becher da 200 ml.NOTA: Gli embrioni di blastula decorionata e gastrula sono molto delicati. Il loro tuorlo esposto aderisce alle superfici plastiche e si rompe a contatto con l’aria. Quindi, devono rimanere completamente immersi nel mezzo embrionale, trasferiti con un pipetto di vetro e mantenuti in piatti di plastica rivestiti di agarosio (1% in mezzo embrionale) o piastre di Petri di vetro. Svuotare con cura la maggior parte del mezzo embrionale e riempire lentamente il becher con un mezzo embrionale fresco. La lieve agitazione causata in questo modo faciliterà la rimozione dei cori indeboliti. Ripeti questo passaggio 2-3 volte. Trasferire gli embrioni decorionati utilizzando una pipetta pasteur di vetro in una piastra per iniezione rivestita di agarosio.NOTA: Infiammare la punta della pipetta Pasteur di vetro esponendola a una fiamma del bruciatore Bunsen può sciogliere e levigare il bordo, contribuendo a prevenire danni agli embrioni. Iniettare l’mRNA che codifica la proteina marcata fluorescentemente in un sottoinsieme di embrioni (una descrizione dettagliata di questa procedura è stata pubblicata da Rogers, K. W. et al.14). Iniettare l’mRNA nella cellula, non nel tuorlo, per un’espressione quasi omogenea. Gli embrioni iniettati serviranno come donatori, mentre gli embrioni non iniettati serviranno come ospiti.NOTA: La quantità e il tipo di mRNA iniettato dipenderanno dalla molecola di segnalazione studiata e di solito varia da 20 a 200 pg2,4,5,6 (ma può arrivare fino a 1000 pg in alcuni casi4). Trasferire gli embrioni iniettati in un piatto a sei pozzetti rivestito di agarosio riempito con terreno embrionale. Incubare a 28 °C fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio iniziale della sfera. Trapianto di cellule per generare fonti ectopiche. Riempire una capsula da trapianto (con singoli pozzetti triangolari a forma di cuneo, vedere Tabella dei materiali) con la soluzione di Ringer (116 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM CaCl2, 5 mM HEPES; conservare il tampone HEPES a 4 °C).NOTA: Il calcio nella soluzione di Ringer favorisce l’adesione cellulare e aiuta l’embrione a guarire dalla procedura di trapianto. Trasferire gli embrioni nel piatto di trapianto. Posizionare gli embrioni ospiti e donatori in colonne alternate, in ogni caso con il palo animale orientato verso l’ago del trapianto. Effettuare il trapianto come descritto al paragrafo 1.3. Per il trapianto di origine ectopica, prelevare le cellule sorgente dalla parte superiore del polo animale e depositarle nella stessa posizione nell’embrione ospite (Figura 1E).NOTA: Il lavaggio delle cellule con la soluzione di Ringer come descritto nel passaggio 1.3.8 è importante per la generazione di sorgenti ectopiche per assicurarsi che le molecole di segnalazione già secrete non vengano trasportate all’ospite. Non trapiantare troppe cellule per garantire che la fonte non sia dispersa. Una colonna di circa 80 μm di diametro e 100 μm di lunghezza è adatta per molte applicazioni. Lasciare che l’embrione ospite rimanga nella soluzione di Ringer per 30 minuti a 1 ora per recuperare. Esaminare se le cellule sono state trapiantate con successo utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 2). Dopo il recupero, trasferire gli embrioni in una piastra a sei pozzetti rivestita di agarosio riempita con terreno embrionale e incubarli a 28 °C. 3. Generazione di embrioni con dimensioni ridotte mediante estirpazione cellulare Preparare gli embrioni per l’estirpazione. Raccogli embrioni appena deposti da zebrafish del genotipo desiderato. Incubare gli embrioni a 28 °C fino a raggiungere lo stadio più alto. Decoerniare gli embrioni come descritto nelle fasi 2.1.2-2.1.5 quando gli embrioni raggiungono lo stadio più alto.NOTA: in questo esempio, l’estirpazione delle celle viene eseguita nella fase della sfera. Di conseguenza, gli embrioni vengono deconizionati circa 30 minuti a 1 ora prima. Facoltativo: etichettatura dello strato sinciziale del tuorlo (YSL).NOTA: Se lo si desidera, iniettare dextrans fluorescente nell’YSL prima di estirpare le cellule. Questa tecnica consente di determinare se l’YSL rimane intatto dopo la rimozione delle cellule, che è importante per la normale embriogenesi15. In alternativa, gli mRNA o le proteine sintetizzati in vitro possono anche essere iniettati nell’YSL. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire gli embrioni decorionati in una piastra di iniezione rivestita di agarosio riempita con acqua embrionale. Orientare gli embrioni lateralmente, con il margine del blastoderma rivolto verso l’ago da iniezione (Figura 3A). Iniettare 0,5 nL di 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran nella YSL, mirando a una regione tra le cellule del blastoderma e il tuorlo ad una profondità di circa un terzo del diametro dell’embrione. Iniettare tutti gli embrioni all’interno di una riga.NOTA: Poiché l’ago per iniezione non ha bisogno di perforare il corion, un’apertura piccola (~ 4 μm) e affilata è vantaggiosa. Ruotare gli embrioni di 180° in modo che il lato opposto del margine del blastoderma sia rivolto verso l’ago per iniezione (Figura 3A). Iniettare altri 0,5 nL di 1,5 μg/μL 10 kDa Alexa568-Dextran nella YSL come descritto nel passaggio 3.2.3, ottenendo un volume totale di iniezione di 1 nL per embrione.NOTA: l’iniezione da due lati consente una distribuzione più uniforme del destrano fluorescente all’interno dell’YSL. Esaminare il risultato dell’iniezione sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Se fatto correttamente, il segnale fluorescente sarà limitato alla YSL (Figura 3B) e non sarà visibile nello spazio intercellulare del blastoderma. Estirpazione delle cellule Riempire una capsula da trapianto con la soluzione di Ringer (vedere il passaggio 2.2.1). Trasferire gli embrioni nella piastra di trapianto. Orientare gli embrioni con il palo animale verso l’ago del trapianto (Figura 3C). Rimuovere con attenzione le cellule dalla regione del polo animale come descritto nei passaggi 1.3.5-1.3.7, riducendo così il blastoderma alla dimensione desiderata. Scartare le cellule rimosse espellendole dall’ago del trapianto. Una volta completata la procedura, lasciare che gli embrioni rimangano nella soluzione di Ringer per 30 minuti a 1 ora per recuperare. FACOLTATIVO: Esaminare l’integrità dell’YSL in uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 3D). Trasferire gli embrioni in una piastra rivestita di agarosio riempita con terreno embrionale e incubarli a 28 °C. 4. Creazione di mutanti materno-zigoti mediante trapianto germinale Preparazione di embrioni ospiti e donatori. Raccogli embrioni appena deposti da pesci zebra sia mutanti che selvatici. Gli embrioni di zebrafish con uno sfondo mutante serviranno come donatori, mentre gli embrioni di zebrafish con uno sfondo di tipo selvatico serviranno come ospiti.NOTA: Il trapianto germinale richiede un numero elevato di embrioni iniziali (~ 50 per i donatori, ~ 500 per gli ospiti) per garantire un buon numero di trapianti germinali di successo che sopravvivono fino all’età adulta. Trasferire gli embrioni in una capsula per iniezione rivestita di agarosio con mezzo embrionale utilizzando una pipetta Pasteur.NOTA: le iniezioni vengono eseguite prima della deconionezione per aumentare la produttività. Gli aghi per iniezione attraverso il corion devono essere smussati e avere un’apertura più grande (~ 10 μm) per evitare l’intasamento. Iniettare gli embrioni donatori con 1 nL di mRNA 100 ng/μL codificante GFP con un nos1 3’UTR. Iniettare l’mRNA nel tuorlo per aumentare la produttività.NOTA: Il nos1 3’UTR stabilizzerà l’mRNA nelle cellule germinali primordiali, causando una forte fluorescenza delle cellule germinali quando fotografate 1 giorno dopo la fecondazione10. Iniettare gli embrioni ospiti con 1 nL di 0,33 mM (3 μg/μL) di morfolino senza uscita (dnd ). Iniettare il morfolino nel tuorlo per aumentare la produttività.NOTA: Il morfolino dnd blocca la formazione di cellule germinali primordiali, il che garantisce che la linea germinale dell’embrione ospite sarà popolata esclusivamente con cellule del donatore dopo il trapianto10. Trasferire gli embrioni iniettati in piastre di Petri di plastica con mezzo embrionale. Incubare a 28 °C fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio più alto. Decoerniare gli embrioni come descritto nelle fasi 2.1.2-2.1.5 quando gli embrioni raggiungono lo stadio più alto. Trapianto di cellule germinali Riempire una capsula da trapianto con la soluzione di Ringer (vedere il passaggio 2.2.1). Trasferire gli embrioni decorionati in fase di cupola nella piastra di trapianto. Posizionare gli embrioni ospiti e gli embrioni donatori in colonne alternate per trapiantare le cellule da un embrione donatore a sei diversi embrioni ospiti. Ciò aumenta la possibilità che le cellule germinali di un determinato embrione ospite vengano trapiantate con successo. Orientare gli embrioni con il margine verso l’ago del trapianto ed effettuare il trapianto come descritto al paragrafo 1.3. Per i trapianti germinali (Figura 1D, F), prendere le cellule sorgente dal margine (dove si trovano le cellule germinali primordiali) e depositarle nella stessa posizione nell’embrione ospite.NOTA: il trapianto di una colonna di grandi dimensioni (circa 80 μm di diametro e 600 μm di lunghezza) aumenterà la possibilità di ottenere un trapianto germinale di successo. Lasciare che l’embrione rimanga nella soluzione di Ringer per 30 minuti a 1 ora per recuperare una volta completato il trapianto.NOTA: Se non ci si aspetta che tutti gli embrioni donatori siano mutanti omozigoti – ad esempio, se derivano da un incrocio eterozigote – devono essere genotipizzati dopo il trapianto per determinare il genotipo della futura linea germinale trapiantata dell’ospite. In questo caso, assicurarsi che le posizioni degli embrioni ospiti e donatori non siano confuse durante la manipolazione. Utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per esaminare se le cellule sono state trapiantate con successo (Figura 4A,B). Trasferire gli embrioni in una piastra rivestita di agarosio a 24 pozzetti. Raggruppare tutti gli embrioni ospiti che hanno ricevuto cellule dallo stesso donatore nello stesso pozzo ed etichettarli di conseguenza. Incubarli fino al giorno successivo a 28 °C. Se necessario, trasferire gli embrioni donatori in strisce PCR etichettate per la genotipizzazione. Screening per trapianti germinali di successo Esaminare gli embrioni ospiti per trapianti germinali di successo sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza di circa 30 ore dopo la fecondazione (hpf). Le cellule germinali si trovano nel solco sopra l’estensione del tuorlo (Figura 4C).NOTA: Gli esperimenti tipici con il dispositivo e la strategia qui presentati avranno un tasso di successo di ~ 60% -80% per ottenere almeno un embrione ospite che trasporta cellule germinali trapiantate per embrione donatore. Un rapporto precedente descriveva un’efficienza del ~ 10. Se del caso, scartare gli embrioni che hanno ricevuto cellule da embrioni donatori con un genotipo errato. Coltiva larve con cellule germinali trapiantate con successo fino all’età adulta secondo le condizioni di allevamento standard e seguendo le linee guida istituzionali.