一种简单有效的斑马鱼胚胎移植装置

1. 组装和使用移植装置 组装移植装置。 连接鲁尔吸头25 μL气密注射器和带鲁尔锁接头的微量移液管支架，以组装移植装置（图1A）。注：用一层薄薄的水膜润湿鲁尔尖端有助于通过水的附着力和内聚力将部件固定在一起，从而增强连接。 将设备直接安装到手动显微操作器上（图1B）。该设备可以仅用惯用手控制，从而腾出另一只手来完成其他任务。 准备移植针。 通过用微量移液器拉动玻璃毛细管移液器（无细丝）来生产移植针。 尽可能顺利地折断针尖，因为锋利的边缘增加了移植时划伤蛋黄的机会，这对胚胎是致命的。注意：在立体显微镜下，用直边剃须刀片可以很容易地打破尖端。但是，使用微锻件可以生成所需尺寸的精确开口。对于异位源的产生，外径约为50-60μm是合适的。对于拔除和种系移植，针头的外径应测量约80-90μm以增加移植细胞的数量。 将即用型针头插入移植装置（图1A）。 使用移植装置。将带有移植装置的显微操作器放在立体显微镜旁边（图1B）。 取下柱塞，将移植针以45°角放入充满林格溶液的移植皿中（见步骤2.2.1），直到针尖浸入（图1B）。由于毛细血管的作用，水会冲上针头。 将柱塞插入大约一半以冲洗出Ringer溶液，在针的薄而锥形的部分只留下少量水（图1C）。注意：这是中性位置，水位应该在那里稳定一段时间（>20分钟）。如果水位不稳定，则空气泄漏;重新连接鲁尔锁接头或更换注射器。 第一次使用移植针时，通过从牺牲的胚胎中吸取蛋黄，然后完全排出蛋黄材料来涂覆其内部。涂层将有助于减少细胞在随后的程序中粘附在玻璃上的粘附。 在针头的帮助下轻轻定位供体胚胎，然后将针头开口正交定位到胚胎表面（图1D）。注意：对于不同的测定，位置会有所不同。对于异位信号分子源的产生和细胞灭绝，这将是动物极的顶部（图1E）;对于种系移植，这将是边缘（图1D，F）。 缓慢而小心地拉起柱塞，将细胞吸入针头。注意：如果细胞被吸收得太快，它们可能会受损。如果操作正确，细胞应以圆柱形柱的形式出现。避免将蛋黄带入针头，因为移植的蛋黄对宿主胚胎有毒。 一旦吸入所需数量的细胞，通过轻轻向下推动柱塞来停止吸力。通过以短而快速的动作将针头抽搐到一侧，将针头从胚胎中取出。在细胞柱的两侧留下一些林格氏溶液，并将细胞限制在针的锥形端（图1C，D）。注意：在沉积细胞柱时，细胞柱前面的液体将有助于迫使宿主胚胎的细胞分开。 通过缓慢上下移动柱塞来清除任何剩余的蛋黄或细胞碎片 – 而针头保持浸泡状态 – 用Ringer溶液洗涤细胞。如果操作正确，未损坏的细胞将保持粘附在柱子中，同时将碎片冲走。注意：在此步骤中必须格外小心，因为水位将超过针的锥形端。这将导致水的突然涌入，可用于洗涤细胞。但是，一旦水位超过锥形端，柱塞的精细控制就会减少，柱塞必须更缓慢，更小心地移动。 用非惯用手移动移栽盘，将针头正交于宿主胚胎的表面（动物杆或边缘）（图1D-F）。 轻轻地施加轻微的压力，然后给予快速，尖锐的运动以刺穿宿主胚胎的包裹层。注意不要用针刮伤蛋黄。注意：通过小心地将其挤压在孔壁上来对胚胎施加轻微的压力会增加胚胎的表面张力，从而促进包络层的穿孔。 一旦针头进入，轻轻推动柱塞将细胞柱挤出到胚胎中，同时缓慢地缩回针头（图1D-F）。 清洁移植针头。 在将针头浸入去离子水中时，通过上下移动柱塞来冲洗针头。注意：如果针头仍然脏污，请先用10 M氢氧化钠溶液冲洗，然后再用水冲洗。 将针头存放在适当的盒子中以备将来使用。 2. 在斑马鱼胚胎中产生分泌信号分子的异位来源 准备宿主和供体胚胎。 通过交配斑马鱼收集新鲜产下的胚胎。 通过在0.5mg / mL的pronase溶液中在小玻璃培养皿中孵育多达100个胚胎约15分钟来去除1细胞阶段斑马鱼胚胎（该过程的详细说明已由Rogers，K.W.等人发表）。注意：或者，胚胎也可以在移植前的高阶段进行去鞘化（步骤2.2），但这需要分别对注射的供体胚胎和未注射的宿主胚胎进行去鞘化。 将胚胎浸没在200 mL烧杯中的胚胎培养基中。注意：去鞘胚芽和胃裂期胚胎非常脆弱。它们暴露的蛋黄会粘附在塑料表面上，并在与空气接触时破裂。因此，它们必须完全浸入胚胎培养基中，用玻璃移液管转移，并保持在琼脂糖涂层（胚胎培养基中为1%）的塑料皿或玻璃培养皿中。 小心地清空大部分胚胎培养基，并用新鲜的胚胎培养基慢慢填充烧杯。以这种方式引起的轻度躁动将有助于去除减弱的绒毛膜。重复此步骤2-3次。 使用玻璃巴斯德移液管将去角质的胚胎转移到琼脂糖涂层的注射皿中。注意：将玻璃巴斯德移液器的尖端暴露在本生燃烧器火焰中可以熔化并平滑边缘，有助于防止对胚胎的损伤。 将编码荧光标记蛋白的mRNA注射到胚胎的子集中（Rogers，K.W.等人已经发表了对该程序的详细说明）。将mRNA注射到细胞中，而不是蛋黄中，以获得近乎均匀的表达。注射的胚胎将作为供体，而未注射的胚胎将作为宿主。注意：注射的mRNA的数量和类型将取决于所研究的信号分子，通常范围为20至200 pg2，4，5，6 （但在某些情况下可高达1000 pg4）。 将注射的胚胎转移到充满胚胎培养基的琼脂糖涂层的六孔培养皿中。在28°C下孵育，直到胚胎达到早期球体阶段。 移植细胞以产生异位源。 用林格氏溶液（116 mM NaCl，2.8 mM KCl，1 mM CaCl2，5 mM HEPES;将HEPES缓冲液储存在4°C）填充移植培养皿（具有单个三角形楔形孔，见材料表）。注意：Ringer溶液中的钙促进细胞粘附，并帮助胚胎从移植过程中愈合。 将胚胎转移到移植皿中。 将宿主和供体胚胎放置在交替的柱中，在每种情况下，动物杆都朝向移植针。 按照第1.3节所述进行移植。对于异位源移植，从动物极的顶部取源细胞并将其沉积到宿主胚胎中的相同位置（图1E）。注意：按照步骤1.3.8中的详细介绍，用Ringer溶液洗涤细胞对于异位源的产生非常重要，以确保已经分泌的信号分子不会携带到宿主。不要移植太多细胞，以确保源头不分散。直径约 80 μm、长度约 100 μm 的色谱柱适用于许多应用。 让宿主胚胎在林格的溶液中停留30分钟至1小时以恢复。 使用荧光立体显微镜检查细胞是否成功移植（图2）。 恢复后，将胚胎转移到充满胚胎培养基的琼脂糖包被的六孔板中，并在28°C下孵育。 3. 通过细胞灭绝产生尺寸减小的胚胎 准备胚胎灭绝。 从所需基因型的斑马鱼中收集新鲜产下的胚胎。 将胚胎在28°C孵育至达到高阶段。 当胚胎达到高阶段时，按照步骤2.1.2-2.1.5所述对胚胎进行脱壳。注意：在本例中，细胞灭绝是在球体阶段进行的。因此，胚胎在大约30分钟至1小时前被去鞘化。 可选：标记蛋黄合胞层 （YSL）。注意：如果需要，在灭活细胞之前将荧光葡聚糖注射到YSL中。该技术可以确定YSL在细胞移除后是否保持完整，这对于正常的胚胎发生很重要15。或者， 体外 合成的mRNA或蛋白质也可以注射到YSL中。 使用巴斯德移液管将去脉的胚胎转移到充满胚胎水的琼脂糖涂层注射皿中。 将胚胎横向定向，胚芽孢子边缘指向注射针（图3A）。 将0.5 nL的1.5μg/ μL 10 kDa Alexa568-Dextran注入YSL中，目标是胚芽细胞和蛋黄之间的区域，深度约为胚胎直径的三分之一。在一排内注射所有胚胎。注意：由于注射针不需要刺穿绒毛膜，因此小（~4μm）和尖锐的开口是有利的。 将胚胎旋转180°，使胚芽孢子边缘的另一侧指向注射针（图3A）。 如步骤3.2.3所述，将另外0.5 nL的1.5μg/ μL 10 kDa Alexa568-葡聚糖注入YSL中，每个胚胎的总注射体积为1 nL。注意：从两侧注射允许荧光葡聚糖在YSL内更均匀地分布。 在荧光立体显微镜下检查注射结果。如果操作正确，荧光信号将被限制在YSL（图3B）中，并且在胚泡的细胞间空间中不可见。 灭活细胞 用林格溶液填充移植皿（见步骤2.2.1）。 将胚胎转移到移植皿中。 将胚胎与动物杆朝向移植针（图3C）。 如步骤1.3.5-1.3.7所述，小心地从动物极点区域除去细胞，从而将胚泡减小到所需的大小。 通过从移植针中排出去除的细胞来丢弃它们。 一旦程序完成，让胚胎在Ringer的溶液中停留30分钟至1小时以恢复。 可选：在荧光立体显微镜下检查YSL的完整性（图3D）。 将胚胎转移到充满胚胎培养基的琼脂糖包被的板中，并在28°C下孵育。 4. 通过种系移植产生母体-合子突变体 准备宿主和供体胚胎。 从突变型和野生型斑马鱼中收集新鲜产下的胚胎。来自具有突变背景的斑马鱼的胚胎将作为供体，而来自具有野生型背景的斑马鱼的胚胎将作为宿主。注意：种系移植需要大量的起始胚胎（供体约为50个，宿主约为500个），以确保大量成功的种系移植存活到成年期。 使用巴斯德移液管将胚胎转移到带有胚胎培养基的琼脂糖涂层注射皿中。注意：注射在脱壳前完成，以提高通量。通过绒毛膜注射的针需要钝化并具有较大的开口（〜10μm）以防止堵塞。 用1 nL的100 ng / μL mRNA注射供体胚胎，编码带有 nos1 3’UTR的GFP。将mRNA注射到蛋黄中以增加通量。注意： Nos1 3’UTR将稳定原始生殖细胞中的mRNA，使生殖细胞在受精后1天成像时发出强烈的荧光10。 向宿主胚胎注射1 nL 0.33 mM（3μg/ μL） 死端（dnd） 吗啉。将吗啉蛋白注入蛋黄中以增加通量。注意： dnd 吗啉阻断原始生殖细胞的形成，这确保了宿主胚胎的生殖系在移植后将专门填充来自供体的细胞10。 将注射的胚胎转移到具有胚胎培养基的塑料培养皿中。在28°C下孵育，直到胚胎达到高阶段。 当胚胎达到高阶段时，按照步骤2.1.2-2.1.5所述对胚胎进行脱壳。 生殖细胞移植 用林格溶液填充移植皿（见步骤2.2.1）。 将去角球到圆顶阶段的胚胎转移到移植皿中。 将宿主胚胎和供体胚胎交替放置柱中，将细胞从一个供体胚胎移植到六个不同的宿主胚胎中。这增加了来自给定宿主胚胎的生殖细胞成功移植的机会。 将边缘的胚胎朝向移植针，并按照第1.3节所述进行移植。对于种系移植（图1D，F），从边缘（原始生殖细胞所在的位置）取源细胞并将其沉积到宿主胚胎中的相同位置。注意：移植一个大柱（直径约80μm，长度约600μm）将增加获得成功种系移植的机会。 让胚胎在林格的溶液中停留30分钟至1小时，以便在移植完成后恢复。注意：如果不是所有的供体胚胎都被认为是纯合突变体 – 例如，如果它们是由杂合杂交产生的 – 它们需要在移植后进行基因分型，以确定宿主移植的未来种系的基因型。在这种情况下，请确保宿主和供体胚胎的位置在处理过程中不会混淆。 使用荧光立体显微镜检查细胞是否成功移植（图4A，B）。 将胚胎转移到24孔琼脂糖包被的板中。将所有从同一供体接收细胞的宿主胚胎分组到同一孔中，并相应地标记它们。将它们孵育至第二天在28°C。 如果需要，将供体胚胎转移到标记的PCR条中进行基因分型。 筛查成功的种系移植 在受精后约30小时（hpf）的荧光立体显微镜下筛选宿主胚胎以成功进行种系移植。生殖细胞位于蛋黄延伸上方的凹槽处（图4C）。注意：使用此处介绍的设备和策略的典型实验将具有〜60%-80%的成功率，以获得每个供体胚胎至少一个携带移植生殖细胞的宿主胚胎。之前的一份报告描述了约 10% 的效率10。 如果适用，丢弃从具有不正确基因型的供体胚胎接收细胞的胚胎。根据标准饲养条件并遵循机构指南，用成功移植的生殖细胞将幼虫培养至成年期。