جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي
Summary
تعد التلاعبات الجنينية مثل استئصال الخلايا وزرعها أدوات مهمة لدراسة التطور المبكر. يصف هذا البروتوكول جهاز زرع بسيط وفعال لإجراء هذه التلاعبات في أجنة حمار وحشي.
Abstract
إن التلاعبات الجنينية الكلاسيكية، مثل إزالة الخلايا وزرع الخلايا داخل الأجنة أو بينها، هي تقنيات قوية لدراسة عمليات النمو المعقدة. تعد أجنة سمك الحمار الوحشي مناسبة بشكل مثالي لهذه التلاعبات نظرا لأنها يمكن الوصول إليها بسهولة ، وكبيرة نسبيا في الحجم ، وشفافة. ومع ذلك ، فإن الأجهزة التي تم تطويرها سابقا لإزالة الخلايا وزرعها مرهقة للاستخدام أو مكلفة للشراء. في المقابل ، فإن جهاز الزرع المعروض هنا اقتصادي وسهل التجميع وبسيط الاستخدام. في هذا البروتوكول، نقدم أولا التعامل مع جهاز الزرع وكذلك تجميعه من الأجزاء المتاحة تجاريا وعلى نطاق واسع. ثم نقدم ثلاثة تطبيقات لاستخدامها: توليد الحيوانات المستنسخة خارج الرحم لدراسة تشتت الإشارات من مصادر موضعية، وتجث الخلايا لإنتاج أجنة منخفضة الحجم، وزرع الجرثومة لتوليد المسوخ الأم الزيجوتية. وأخيرا، نظهر أن الأداة يمكن أن تستخدم أيضا للتلاعب الجنيني في أنواع أخرى مثل ميداكا أسماك الأرز اليابانية.
Introduction
من التجارب الكلاسيكية مانغولد وسبيمان التي أظهرت وجود منظم تعليمات تشكيل محور الجنين1، زرع الخلايا بين الأجنة أصبح تقنية راسخة لدراسة التطور الجنيني2،3،4،5،6،7،8،9،10 . ويتكون الإعداد الشائع الاستخدام للزرع من حقنة ضيقة بالغاز يتم التحكم فيها بواسطة ميكرومتر متصلة بحامل ميكروبايت من خلال أنابيب مرنة وخزان مليء بالزيت المعدني12,13. في هذا الإعداد، يتم نقل المكبس من الحقنة من خلال المسمار. يتم نقل الضغط المتولد بهذه الطريقة إلى الميكروباينيت ويستخدم لسحب الخلايا من جنين واحد وإيداعها في جنين آخر. ومع ذلك، يتكون هذا الجهاز الذي يعمل هيدروليكيا من أجزاء كثيرة وشاقة لتجميع من الصفر. ويمكن أيضا شراء أجهزة مماثلة كجهاز عمل كامل ، وعادة ما تباع كمقنات دقيقة يدوية ، وتكلف هذه الإصدارات التجارية عادة أكثر من 1500 دولار أمريكي. في كل من النسخة المنزلية والتجارية ، يتم فصل micropipette للتلاعب الجنين من الجهاز توليد الضغط (حقنة الغاز ضيق) من خلال أنابيب مملوءة بالنفط. التلاعب في micropipette وحركة المكبس ، لذلك ، يجب أن تعمل بشكل منفصل مع أيدي مختلفة ، والحد من الإنتاجية والفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن الأجهزة مرهقة للتحضير لزرع منذ أنابيب يحتاج إلى أن تكون مليئة بعناية مع النفط مع تجنب تشكيل فقاعات. هنا، نقوم بوصف جهاز بديل يعمل بالهواء المضغوط لإزالة الخلايا وزرعها غير مكلف وسهل التجميع وبسيط الاستخدام.
الجهاز المعروض هنا يتكون من 25 ميكرولتر الغاز ضيق حقنة مزودة حامل micropipette وتكاليف أقل من 80 دولارا أمريكيا تماما. يتم تجميع الجهاز بسهولة عن طريق إدخال حامل micropipette في الحقنة عن طريق تركيب قفل Luer (الشكل 1A). ثم يتم تركيب الجهاز مباشرة على ميكرومانيبولاتور، مما يسمح للمستخدم بالتحكم في كل من موقعه والشفط بيد واحدة مباشرة في المايكرومانيبولاتور. هذا يترك اليد الأخرى حرة لتحقيق الاستقرار ونقل طبق زرع تحتوي على الأجنة المانحة والمضيف. يعمل الجهاز عن طريق الشفط المباشر بالهواء ولا يحتاج إلى ملء بالزيوت المعدنية. نظرا للقوى الجذابة بين الماء وجدران الإبرة الزجاجية ، تترجم حركة كبيرة في المكبس للمحقنة إلى حركة أصغر في مستوى الماء داخل الإبرة ، طالما أن مستوى الماء في النهاية المدببة لل إبرة الزجاج. وهذا يسمح بالتحكم الدقيق في عدد الخلايا المهتتة وموقع إدراجها.
لإثبات فائدة هذا الجهاز، نقدم ثلاثة تطبيقات في أجنة حمار وحشي (دانيو ريو). أولا، نعرض كيفية توليد مصادر مترجمة لجزيئات الإشارات المفرزة، والتي يمكن استخدامها لدراسة تشكيل التدرج2،4،6. هنا، يتم حقن الأجنة المانحة مع مرنا ترميز جزيء إشارة المسمى الفلورسنت. ثم يتم زرع الخلايا المانحة المسماة بالفلورسينس إلى أجنة مضيفة من النوع البري حيث يمكن تصوير تكوين تدرج الإشارة وتحليله. ثانيا، نحن نصف كيف يمكن استخدام الجهاز لإزالة الخلايا عن طريق الخلع من أجل توليد الأجنة ذات الحجم المنخفض5،13. وأخيرا، نظهر كيفية إنتاج المسوخ الأم الزيجوتية بقوة عن طريق زرع خلايا تحمل مراسل الخلايا الجرثومية البدائية في الأجنة المضيفة التي تم فيها استئصال الخط الجرثومي 6,10. في المستقبل، يمكن تكييف جهاز الزرع الموصوف هنا بسهولة مع التلاعبات الجنينية الأخرى التي تتطلب إزالة أو زرع الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد نجاح تجربة الزرع بقوة على المهارات الحركية الدقيقة للمجرب. ومن أجل تنفيذ الإجراءات بنجاح، يلزم ممارسة هذه العملية. ومع ذلك ، فإن الأداة المعروضة هنا سهلة التعلم والاستخدام نسبيا مقارنة بالآخرين في السوق ، وبشكل عام ، لا تحتاج إلا إلى بضعة أيام من الممارسة.
يمكن تعزيز نجاح عملية الزرع من خلال اتخاذ العديد من الاحتياطات. خطوة واحدة هي التأكد من أن micromanipulator هو من نوعية جيدة وقادرة على التشغيل السلس. إضافة العين مع التكبير أعلى إلى المنظار المجسم يمكن أن تساعد على وضع الإبرة بدقة بالنسبة للجنين. كما أن استخدام سمك الحمار الوحشي أو ميداكا الذي يتكاثر بشكل جيد للحصول على أجنة سليمة والحرص على عدم إتلاف الأجنة أثناء المناولة (خاصة أثناء وبعد خطوة التخلص من المشيمة) سيعزز أيضا معدل النجاح.
يمكن أن تكون المشاكل المتعلقة بالسمية المتأخرة أكثر صعوبة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها. إذا توفي الجنين بعد بضع ساعات – ولكن ليس بعد زرعه مباشرة – فقد يكون الصفار قد تضرر من الإبرة (على سبيل المثال، عن طريق دخول الجنين بعمق شديد)، أو ربما تم إخراج الخلايا بقوة كبيرة. ويمكن أن ينتج تأخر السمية والوفاة الجنينية أيضا عن صفار أو حطام خلايا حقن مع الخلايا المانحة؛ يمكن أن يكون سبب آخر تدهور HEPES المخزن المؤقت في الحل Ringer. يمكن التغلب على هذه المشاكل عن طريق غسل الخلايا (انظر الخطوة 1.3.8) أو ببساطة باستخدام دفعة جديدة من المخزن المؤقت، على التوالي. وعلاوة على ذلك، قد تنتج الأجنة المضيفة المشوهة في تجارب زرع الجرثومة عن تركيزات مورفولينو عالية للغاية. من الأهمية بمكان استخدام ما يكفي من مورفولينو لإبطال الجرثومة البرية للمضيف بشكل كامل ، وبالتالي منع هذه الخلايا من المساهمة في النسل – ولكن في الوقت نفسه ، يجب تجنب تركيزات مورفولينو العالية بشكل مفرط. ولذلك فإن كميات المورفولينو المتسقة عبر جميع الأجنة المضيفة المحقونة (بضع مئات في تجربة نموذجية) هي المفتاح لنجاح عمليات زرع الجراثيم. ويمكن مساعدة هذا عن طريق استكمال مزيج حقن مورفولينو مع dye14 التتبع مرئية بسهولة, والتي يمكن تعقبها تحت مجسم مفلورة لضمان أن جميع الأجنة تلقي نفس حجم الحقن.
تتضمن الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول حصريا التلاعب بالخلايا في أجنة حمار وحشي أو ميداكا في مرحلة blastula ، ولكن في المستقبل ، من المرجح أن يكون من الممكن تكييف الجهاز مع مراحل وأنواع مختلفة عن طريق تغيير قطر وشكل إبرة الزرع.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا المشروع من قبل جمعية ماكس بلانك وحصل على تمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 (اتفاقية المنحة رقم 637840 (QUANTPATTERN) واتفاقية المنح رقم 863952 (ACE-OF-SPACE)).
Materials
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
Riferimenti
- Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
- Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
- Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
- Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
- Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
- Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
- Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).
