Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti
Summary
Il rilevamento delle interazioni patogeno ospite-batterico basate sull’aderenza fenotipica utilizzando l’imaging di etichettatura a fluorescenza ad alto rendimento insieme a metodi di analisi statistica automatizzati consente una rapida valutazione delle potenziali interazioni batteriche con le cellule ospiti.
Abstract
L’identificazione di patogeni batterici emergenti è fondamentale per la salute e la sicurezza umana. L’aderenza batterica alle cellule ospiti è un passo essenziale nelle infezioni batteriche e costituisce un segno distintivo di potenziale minaccia. Pertanto, l’esame dell’aderenza dei batteri alle cellule ospiti può essere utilizzato come componente della valutazione della minaccia batterica. Un metodo standard per enumerare l’aderenza batterica alle cellule ospiti è quello di co-incubare i batteri con le cellule ospiti, raccogliere i batteri aderenti, placcare le cellule raccolte su mezzi solidi e quindi contare le unità formanti colonie risultanti (CFU). In alternativa, l’aderenza batterica alle cellule ospiti può essere valutata utilizzando approcci basati sulla microscopia a immunofluorescenza. Tuttavia, le strategie convenzionali per l’attuazione di questi approcci richiedono molto tempo e sono inefficienti. Qui viene descritto un metodo di imaging automatizzato basato sulla microscopia a fluorescenza sviluppato di recente. Se combinato con l’elaborazione delle immagini ad alto rendimento e l’analisi statistica, il metodo consente una rapida quantificazione dei batteri che aderiscono alle cellule ospiti. Due specie batteriche, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa e Gram-positive Listeria monocytogenes e corrispondenti controlli negativi, sono state testate per dimostrare il protocollo. I risultati mostrano che questo approccio enumera rapidamente e accuratamente i batteri aderenti e riduce significativamente i carichi di lavoro e le tempistiche sperimentali.
Introduction
L’adesione batterica è un processo in cui i batteri si attaccano ad altre cellule o superfici. L’instaurazione di successo dell’infezione da parte di agenti patogeni batterici richiede l’adesione alle cellule ospiti, la colonizzazione dei tessuti e, in alcuni casi, l’invasione delle cellule ospiti1,2,3. Le malattie infettive emergenti costituiscono gravi minacce per la salute pubblica, come evidenziato dalla recente pandemia di COVID-194,5,6. È importante sottolineare che i patogeni nuovi o emergenti potrebbero non essere facilmente individuati utilizzando approcci basati sulla genomica, specialmente nei casi in cui l’agente patogeno è stato progettato per eludere il rilevamento o non contiene firme genomiche che lo identificano come patogeno. Pertanto, l’identificazione di potenziali agenti patogeni utilizzando metodi che valutano direttamente i segni distintivi della patogenicità, come l’aderenza batterica alle cellule ospiti, può svolgere un ruolo critico nell’identificazione dei patogeni.
L’aderenza batterica alle cellule ospiti è stata utilizzata per valutare i meccanismi di patogenesi batterica per decenni1,7. L’imaging microscopico8,9 e l’enumerazione dell’unità di formazione di colonie batteriche (CFU)10,11,12,13 mediante placcatura post-infezione sono due metodi di laboratorio ben sviluppati per testare l’aderenza microbica e/o l’infezione delle cellule ospiti14. Considerando la dimensione della scala micrometrica delle cellule batteriche, l’enumerazione delle cellule batteriche aderenti richiede generalmente l’uso di tecniche avanzate di microscopia ad alto ingrandimento, nonché approcci di imaging ad alta risoluzione, tra cui microscopia elettronica, microscopia ad espansione (ExM)15,16e imaging tridimensionale17 . In alternativa, l’enumerazione dei batteri legati o internalizzati all’interno delle cellule ospiti può essere eseguita placcando la serie di diluizione dei batteri raccolti su agar solido e contando le CFU risultanti10,12,13. Questo metodo è laborioso e include molti passaggi manuali, che introduce difficoltà nello stabilire una procedura standardizzata o automatizzata richiesta per le analisi ad alto rendimento18,19. Pertanto, lo sviluppo di nuovi metodi per valutare l’attaccamento delle cellule ospiti affronterebbe le attuali limitazioni nel campo.
Uno di questi metodi è descritto qui che utilizza la microscopia automatizzata ad alto throughput, combinata con l’elaborazione delle immagini ad alto throughput e l’analisi statistica. Per dimostrare l’approccio, sono stati eseguiti esperimenti con diversi patogeni batterici, tra cui Pseudomonas aeruginosa, un patogeno batterico Gram-negativo opportunistico di esseri umani, animali e piante14,20, che si trova spesso a colonizzare il tratto respiratorio di pazienti con funzioni di difesa dell’ospite compromesse. Questo approccio ha ottimizzato il processo di imaging microscopico descritto in precedenti studi14,20. Il rilevamento dell’imaging è stato semplificato da cellule ospiti e batteri marcati con fluorescenza per tracciare rapidamente la vicinanza di essi, il che ha ridotto drasticamente il carico di lavoro della microscopia per ottenere immagini ad alta risoluzione per distinguere i batteri. Inoltre, l’analisi statistica automatizzata delle immagini nel conteggio delle cellule ospiti e dei batteri ha sostituito l’esperimento pratico di placcatura CFU batterica per stimare il rapporto tra conta batterica aderente per cellula ospite. Per confermare la compatibilità di questo metodo, sono stati testati anche più ceppi batterici e tipi di cellule ospiti, come Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus , Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, così come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), e i risultati supportano la diversità e l’efficacia del metodo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descrive un approccio automatizzato per enumerare l’attaccamento batterico alle cellule ospiti. L’approccio descritto presenta diversi vantaggi interessanti rispetto ai metodi convenzionali. In primo luogo, questo approccio consente la quantificazione precisa del numero di cellule patogene microbiche che sono attaccate alle singole cellule ospiti. È importante sottolineare che questa quantificazione può essere eseguita senza la necessità di laboriose raccolte batteriche, diluizioni seriali, placcatura su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al Dr. Kaite Zlotkowski di Biotek Inc. per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento della Difesa con il numero di contratto W911NF1920013 a PdF, dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dal Dipartimento degli Interni con contratto n. 140D6319C0029 a PdF. Il contenuto delle informazioni non riflette necessariamente la posizione o la politica del governo e non dovrebbe essere dedotto alcun avallo ufficiale.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
Riferimenti
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