Förster Resonantie EnergieOverdracht Metingen in Levende Plantencellen
Summary
Er wordt een protocol verstrekt voor het opzetten van een standaard confocale laserscanmicroscoop voor in vivo Förster resonantie energieoverdrachtsmetingen, gevolgd door gegevensevaluatie.
Abstract
Gesensibiliseerde emissie-gebaseerde Förster resonantie energieoverdracht (FRET) experimenten zijn eenvoudig uit te voeren, maar zijn afhankelijk van de microscopische opstelling. Confocale laserscanmicroscopen zijn een werkpaard geworden voor biologen. Commerciële systemen bieden een hoge flexibiliteit in laservermogensaanpassing en detectorgevoeligheid en combineren vaak verschillende detectoren om het perfecte beeld te verkrijgen. Het vergelijken van op intensiteit gebaseerde gegevens van verschillende experimenten en opstellingen is echter vaak onmogelijk vanwege deze flexibiliteit. Bioloogvriendelijke procedures zijn van voordeel en maken een eenvoudige en betrouwbare aanpassing van laser- en detectorinstellingen mogelijk.
Aangezien FRET-experimenten in levende cellen worden beïnvloed door de variabiliteit in eiwitexpressie en donor-acceptorverhoudingen, moeten eiwitexpressieniveaus bovendien in aanmerking worden genomen voor gegevensevaluatie. Hier wordt een eenvoudig protocol beschreven voor betrouwbare en reproduceerbare FRET-metingen, inclusief routines voor de schatting van eiwitexpressie en aanpassing van laserintensiteit en detectorinstellingen. Gegevensevaluatie zal worden uitgevoerd door kalibratie met een fluorofoorfusie van bekende FRET-efficiëntie. Om de eenvoud te verbeteren, zijn correctiefactoren vergeleken die zijn verkregen in cellen en door recombinante fluorescerende eiwitten te meten.
Introduction
Förster resonantie energieoverdracht ((F)RET) wordt meestal waargenomen door fluorescentiespectroscopie, hoewel het proces zelf niet beperkt is tot het optreden tussen fluoroforen. De onderliggende dipool-dipoolkoppeling vereist eenvoudigweg een lichtuitstralend donormolecuul en een lichtabsorberende acceptor. Dit is afgeleid van de vereiste spectrale overlap integraal J van de genormaliseerde donoremissie en acceptorabsorptiespectra1. Omdat RET echter concurreert met fluorescentie, wordt de energieoverdracht meetbaar door veranderingen in fluorescentie-emissie: RET induceert donorblussing en gesensibiliseerde acceptoremissie.
Fluorofoor-gebaseerde RET is fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) genoemd om het te scheiden van bioluminescentieresonantie-energieoverdracht (BRET). RET is sterk afhankelijk van de afstand tussen donor en acceptor, die breed in het bereik van 0,5-10 nm2 ligt en dus in hetzelfde bereik als de afmetingen van eiwitten en hun complexen. Ten tweede is RET afhankelijk van de dipool-dipool oriëntatie kappa in het kwadraat. Gecombineerd met het feit dat rotatievrijheid van eiwitgebonden fluoroforen kan worden verwaarloosd vanwege het molecuulgewicht en de langzame rotatierelaxatie, maakt RET de analyse van conformatieveranderingen mogelijk3.
De zogenaamde Förster-straal is gebaseerd op de spectrale overlapintegraal en het golflengtebereik van de overlap, zodat rood lichtabsorberende chromoforen resulteren in langere Förster-stralen dan blauw lichtabsorberende kleurstoffen. Omdat het dynamisch bereik van FRET-metingen beperkt is door 0,5 × R0 en 1,5 × R0, heeft het FRET-paar ECFP-EYFP een dynamisch bereik van 2,5-7,3 nm vanwege zijn R0 van 4,9 nm4.
De helderheid van een fluorofoor wordt bepaald door het product van zijn molaire extinctiecoëfficiënt en zijn kwantumopbrengst. Voor FRET-metingen is het voordelig om fluoroforen van bijna vergelijkbare helderheid te kiezen. Dit verbetert de detectie van donor quenching en gesensibiliseerde acceptor emissie. Het bevordert ook de kalibratie van het microscopiesysteem. Kijkend naar de veelgebruikte FRET-paren van cyaan en fluorescerende eiwitten, wordt de lagere helderheid van de cyaan fluorescerende eiwitten duidelijk (figuur 1A).
De levensduur van de acceptor moet echter lager zijn dan de levensduur van de donor, waardoor de beschikbaarheid van de acceptor voor energieoverdracht wordt gewaarborgd. Als de levensduur van de acceptor de levensduur van de donor overschrijdt, kan de acceptor zich nog steeds in de aangeslagen toestand bevinden wanneer de donor weer opgewonden is. Geavanceerde cyaan fluorescerende eiwitten zoals mTurquoise vertonen een langere levensduur en dragen zo bij aan een verhoogde kans op FRET (Figuur1B). De kans op FRET hangt ook af van de molaire extinctiecoëfficiënt van de acceptor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Donorblussing en gesensibiliseerde acceptoremissie worden gekenmerkt door een lineaire relatie die een op donor of acceptor gebaseerde berekening van FRET mogelijk maakt. De overeenkomstige factoren van lineariteit worden ofwel G-factor (donor naar acceptor) of xi (acceptor naar donor) genoemd, wat wederkerige waarden zijn4. Het meten van FRET tussen fluorescerende eiwitten door fluorescentiemicroscopie vereist vaak correcties voor DSBT en ASBT vanwege de brede absorptie- en emissiespectra van de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De experimenten werden uitgevoerd op het Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) van de Faculteit Biologie van de Universiteit van Bielefeld. Dit werk is gefinancierd door de Universiteit van Bielefeld.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
Riferimenti
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it’s done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
