小分子化合物の迅速・定量的検出用横流イムノクロマトグラフィーストリップの開発

Published: November 13, 2021
doi:

Abstract

膜ベースの横流の流れイムノクロマトグラフィーストリップ(ICS)は、低コスト自己診断に有用なツールであり、毒素、生理学的指標および臨床バイオマーカー検出に効率的に適用されています。このプロトコルでは、迅速、敏感、定量的な横流免疫測定(プローブとしてAuNPsをマーカーとして使用)を開発するステップの詳細な説明を提供します。この手順は、コロイド金の調製および特性評価、AuNP-mAbコンジュゲートの合成、免疫クロマトグラフィーストリップの組み立て、およびアッセイの方法論学的調査について説明する。結果は、最終的なストリップが、生理学的および生物学的指標の迅速かつ正確な分析において代替手段となる可能性のある、小分子の迅速かつ便利な自己診断のためにさらに利用できることを示した。

Introduction

膜ベースの横流の流れの免疫クロマトグラフィーストリップ(ICS)は低コストおよび急速な検出のための有用な用具である。免疫クロマトグラフィーのマーカーとしてのニトロセルロース膜とコロイドゴールドは、最も一般的に使用されるPOCT(ケアポイント検査)法であり、プロジェクトの試験範囲は広い。妊娠中のモニタリングにおける彼らの元のアプリケーションから、血液凝固状態1、2、心筋傷害3、獣医学4、残留農薬5、感染症6および薬物濃度を監視するためにその使用が拡張された。尿、唾液、全血、血清および他の体液7、8、9を含む、より多くのタイプのサンプル評価することができる。

近年、HPLC、UPLC、LC-MS、ELISAなどの疾患の診断におけるバイオマーカーの検出に関する新しいアッセイが数多く開発されています。しかし、これらの方法は、洗練された計測、複雑な前処理と時間のかかる治療9を必要とします。したがって、薬用活性化合物の自己およびリアルタイム検出のためのより迅速かつ便利なポイント・オブ・ケア診断戦略を開発することは、緊急の10、11である。

特に一般的なテストでは、ICSの人気は、彼らが専門家や精巧なインストゥルメンタルセットアップ12を必要としないように、その使いやすさによって駆動されます。言い換えれば、特別な訓練を受けていない人は、ストリップや自己テスト13を操作することができます。試験の結果は5分で得ることができ、これは現場検査14に使用できることを意味する。さらに、我々の計算によると、ストリップのコストは1 RMB15よりも低くなる可能性があり、これはテストが16を促進するために安価であることを意味します。したがって、ICSは比較的正確でシンプルで安価な使い捨てデバイスです。コロイドゴールド17、18に基づくICSも、迅速なCOVID-19検出に適用されます。

ICS の原理は、サンドイッチ ICS と競争力のある ICS に分けることができます。 図1A は、主に腫瘍マーカー、炎症因子、およびヒト絨毛性性ゴナドトロピン(HCG、妊娠初期抗原)を含むタンパク質などの高分子物質を検出するために使用されるサンドイッチICSの概略図である。この方法では、抗原の異なるエピトープを標的とした対合抗体が使用され、そして捕捉抗体を試験ラインとしてNC膜上で乾燥させる。標識抗体はコンジュゲートパッド上で乾燥し、二次抗体は対照線として使用される。

図1B は、主に低分子物質(MWCO<2000 Da)の検出に使用される競合性ICSの模式図である。被覆抗原は、試験ラインとしてNC膜上に固定され、標識された抗体はコンジュゲートパッド上で乾燥する。検出中、サンプルと標識された抗体は毛細血管作用下の検出ラインを流れ、被覆された抗原はサンプル中の自由な抗原に競合的に結合し、検出ライン上に赤色を発生させる。

最近、天然物19に対するモノクローナル抗体生成の手順について説明した。本研究では、迅速なオンサイト検出のために調製された抗SSD mA20 に基づく新規の横流フローイムノアッセイを開発しました。この結果は、天然物由来化合物を検出する上で、免疫クロマトグラフィーアッセイが不可欠で便利なツールであることを示しています。

Figure 1
図1 イムノクロマトグラフィーアッセイ(A)サンドイッチイムノクロマトグラフィー試験ストリップの概略図。(B) 間接的な競合性免疫クロマトグラフィーテストストリップ。この図は、Zhang、201821から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

本研究で行われたすべての手順は、北京中医科大学の倫理審査委員会(承認番号2017BZYYL00120)によって承認されました。 コロイド金の作成と特徴付け 注:コロイド金合成では、コロイド金が容器の内壁に容易に吸着され、不純物によって沈殿しやすいため、コロイド金の合成および貯蔵のための容器を徹底的に洗浄し、酸に浸す必要がありま?…

Representative Results

コロイド金の特徴付け準備されたコロイドゴールド溶液はクラレットレッドであった。TEM解析は、AuNPsの形態と形状を決定するために使用されました(図2A-D)。図2A及び図2Bは、粒子が形状が均一に分布している多面体であることを明らかにした。AuNPsの平均直径は約14nmであることが判明した(<strong cl…

Discussion

本研究では、天然物由来の小分子に対するmAbsの調製のためのプロトコルを提示する。重要なステップと、その手順に注意を要する事項を概説し、小分子SSDを例に用いてこのプロトコルの有用性を実証した。スペクトル例、TEM画像、定量的結果および方法論的調査は代表的なデータに示されている。そこで、ここで提示した金コロイド金生産、AuNP-mAbコンジュゲーション、ストリップ組立戦略?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中央部と提携する高等教育機関の基礎研究資金の特別資金によって支援されました。北京中国医学大学の古典処方基礎研究チームの支援に感謝します。

Materials

Chloroauric acid solution (HAuCl4) Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory JY-SJ102
bovine serum albumin AMRESCO 332
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
Filter paper Sinopharm H5072
Glass fibre membranes Jieyi XQ-Y6
goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
Nitrocellulose membranes Millipore millipore 180
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG20000 Sigma Aldrich RNBC6325
Pipette 10mL COSTAR 4488
Pipette 25mL FALCON 357525
semi-rigid PVC sheets Jieyi JY-C104
Sodium citrate Beijing Chemical Works C1034
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021
Tris-HCl Solarbio 77-86-1
TWEEN 20 Solarbio 9005-64-5

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Citazione di questo articolo
Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Cheng, J., Qu, H. Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds. J. Vis. Exp. (177), e62754, doi:10.3791/62754 (2021).

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