نحن نصف الأدوات المحسنة لدراسة قلب حمار وحشي في الجسم الحي مع المجهر مضان ورقة الضوء. على وجه التحديد، نقترح خطوط القلب المعدلة وراثيا مشرق وتقديم تقنيات جديدة لطيف تضمين وشل الحركة التي تجنب عيوب النمو والقلب. كما يتم توفير خط أنابيب محتمل للحصول على البيانات وتحليلها يتكيف مع تصوير القلب.
استفادت أبحاث القلب الجنينية بشكل كبير من التقدم في المجهر الفلوري للصفائح الضوئية الحية (LSFM). جنبا إلى جنب مع التطور الخارجي السريع، وعلم الوراثة القابلة للسحب، وشفافية حمار وحشي، دانيو ريو، قدمت LSFM رؤى في شكل القلب ووظيفته في قرار المكانية والزمنية عالية دون السمية الضوئية كبيرة أو photobleaching. تصوير قلوب الضرب يتحدى إعداد العينة القائمة وتقنيات المجهر. يحتاج المرء إلى الحفاظ على عينة صحية في مجال الرؤية الضيق والحصول على صور فائقة السرعة لحل نبضات القلب. هنا نحن نصف الأدوات والحلول الأمثل لدراسة قلب حمار وحشي في الجسم الحي. نحن نثبت تطبيقات الخطوط المعدلة وراثيا مشرق لتسمية مكونات القلب وتقديم تقنيات جديدة لطيف التضمين وشل الحركة التي تجنب عيوب النمو والتغيرات في معدل ضربات القلب. كما نقترح خط أنابيب لاكتساب البيانات وتحليلها يتكيف مع التصوير القلبي. يركز سير العمل بأكمله المعروض هنا على تصوير القلب الجنيني لسمك الحمار الوحشي ولكن يمكن تطبيقه أيضا على عينات وتجارب أخرى مختلفة.
للكشف عن الأحداث المعقدة والتفاعلات في القلب النابض المبكر ، مطلوب التصوير في الجسم الحي للجهاز بأكمله. مع الحد الأدنى من السمية الضوئية1,2,3, انخفاض photobleaching4, وسرعة عالية, وقد تطورت المجهر ورقة الضوء كأداة التصوير الأولية للتنمية الجنينية والقلب5,6. وقد قدمت رؤى في شكل القلب ووظيفته بدقة مكانية وزمنية عالية7,8,9 وسمحت للباحثين بتصوير وتتبع أجزاء من القلب تحمل علامات فلورية بسرعة عالية، ودراسة القوى الديناميكية الدموية، ومتابعة نمو القلب مباشرة داخل جسم الأجنة النامية6,10,11,12.
ولتقييد سمك الحمار الوحشي على وجه الدقة وعلى نحو مستنسخ في مجال الرؤية، توجد مجموعة متنوعة من بروتوكولات التضمين للصفائح الخفيفة، على المدى القصير والطويل، فضلا عن عينة واحدة أو متعددة العينة13،14،15،16،17،18،19. البروتوكول الأكثر شيوعا ينطوي على شل tricaine وgarose تصاعد داخل أنبوب زجاجي أو بلاستيكي. ومع ذلك ، حيث يمكن أن يتغير معدل ضربات القلب بسبب درجة الحرارة والتخدير والمواد المضمنة المستخدمة 20،21،22 ، يتطلب تصوير القلب حمار وحشي بروتوكولات محددة ولطيفة لضمان صحة العينة 6،8،11،12،20،21،22،23 . للتصوير على المدى القصير (حتى ساعة)، يمكن للمرء تخدير الأسماك في 130 ملغم/لتر تريكين وتضمينها في أنابيب بروبيلين الإيثيلين المفلور (FEP) مع محلول الآغروز بنسبة 0.1٪ وقابس، كما هو موضح في Weber وآخرون. ومع ذلك ، حيث يمكن أن يؤدي tricaine إلى عيوب تنموية20،22 ، يجب استخدام بروتوكولات مختلفة للتصوير على المدى الطويل.
هنا نصف استراتيجية جديدة لتصوير القلب على المدى الطويل. في حين أن العديد من تطبيقات ورقة الضوء exist24، نوصي باستخدام عينة معلقة في المجهر T-SPIM (كشف واحد واثنين من العدسات الإضاءة في مستوى أفقي مع عينة معلقة عموديا في التركيز المشترك). وهذا يعطي حرية الحركة والتناوب اللازمة لتحديد المواقع عينة دقيقة. يتم شل حركة الأسماك عن طريق حقن 30 pg α-bungarotoxin مرنا في مرحلة خلية واحدة أو خليتين. α-bungarotoxin هو سم ثعبان يشل العضلات دون التأثير على نمو القلب والأوعية الدموية أو علم وظائف الأعضاء22. للتصوير الدقيق الخالي من التشويه، نوصي بتركيب الأسماك في أنابيب مصنوعة من FEP، وهو بوليمر مع مؤشر انكسار مطابق تقريبا للماء. نناقش كيفية إعداد أنابيب FEP بشكل أفضل عن طريق استقامتها وتنظيفها قبل التصوير. ثم يتم تركيب الأسماك في هذه الأنابيب ، والرأس إلى أسفل ، في وسائل الإعلام ، ويتم إغلاق الجزء السفلي من الأنبوب مع قابس agarose 2 ٪ ، والتي تقع عليها رؤوس الأسماك. قطع الثقوب في أنبوب FEP يسهل تبادل الغاز ويضمن نمو الأسماك. يمكن الاحتفاظ بالسمك المضمن في الوسائط حتى يتم تركيبه على حامل عينة قبل التصوير مباشرة. كما نقترح الحصول على البيانات وتحليلها للتصوير عالي السرعة القابل للاستنساخ. علاوة على ذلك ، نناقش استخدام خطوط السيتوبلازمية مقابل الغشاء المعدلة وراثيا لوضع علامات قوية على خلايا القلب ، بالإضافة إلى خيارات مختلفة لوقف القلب. تضمن هذه التقنيات المتصاعدة صحة العينة مع السماح بتقييد القلب بدقة واستنساخ في مجال الرؤية.
خطوط معدلة وراثيا لتصوير القلب
الشكل 6: مقارنة بين خطوط السيتوبلازما وعلامة الغشاء حمار وحشي المعدلة وراثيا. منظر أمامي بطني ل 48 قلب حمار وحشي hpf مصورة مع LSFM. تشير الأسهم البيضاء إلى الهياكل المرئية فقط مع خط معدل وراثيا لعلامة الغشاء. (أ) إشارة TG(kdrl:EGFP)32 في سماوي في القلب و (أ)في البطين. (ب) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry؛ إشارة myl7:dsRed)33 باللون الأحمر في القلب و(ب)في البطين. ( ج،ج’) دمج كل من TG (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry؛ myl7:dsRed) و TG(kdrl:EGFP) إشارة. مقياس شريط 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تصوير قلب حمار وحشي يتطلب وضع علامات دقيقة على خلايا القلب. في حين أن سمك عضلة القلب ثابت نسبيا في جميع أنحاء الخلايا ، فإن خلايا الشغاف سميكة حول النواة ولكن لديها نتوءات غشاء رقيقة ، في بعض المناطق أرق من 2 ميكرومتر. خطوط السيتوبلازمية المعدلة وراثيا مثل Tg(kdrl:EGFP)32 تسمية فعالة المناطق حول نواة القلب، ولكن بعيدا، السيتوبلازم رقيقة قد لا تنبعث منها فوتونات كافية ليتم الكشف عنها مع مثل هذه الأوقات التعرض القصير، مما يؤدي إلى ثقوب اصطناعية في البيانات (الشكل 6a). في المقابل، يمكن أن علامات الغشاء خطوط المعدلة وراثيا مثل Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 تسمية بشكل فعال اندروكارديوم وتكشف عن مزيد من التفاصيل (الشكل 6b، ج). لكل تجربة، اختر بعناية الخط المعدل وراثيا الأنسب.
شل حركة سمك الحمار الوحشي
اختيار تقنية شل الحركة يعتمد على طول التجربة وعمر السمكة إلى الصورة. وقد استخدمت عادة Tricaine لشل حمار وحشي، ويرجع ذلك في الغالب إلى سهولة استخدامه. في الواقع، ببساطة إضافة 130 ملغم/لتر tricaine إلى وسائل الإعلام الأسماك النتائج في تخدير في 10 دقيقة. كما يمكن أن يؤدي إلى عيوب النمو وتؤثر على فسيولوجيا القلب20,22, نوصي باستخدام tricaine فقط للتجارب القصيرة (أقل من 30 دقيقة). للتصوير لفترة أطول، α-bungarotoxin حقن مرنا في مرحلة خلية واحدة أو خليتين يشل الأسماك تصل إلى 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) دون التأثير على نمو القلب والأوعية الدموية أو علم وظائف الأعضاء22.
اختيار أنابيب FEP الصحيحة
أنابيب FEP متوفرة في مختلف الأقطار والسماكة. لتصوير السمك 0-5 dpf، 0.8 مم هو قطر داخلي جيد. اختر إما جدار سميك أنابيب 0.8 × 1.6 مم أو جدار رفيع 0.8 × 1.2 مم أنابيب. نوصي أنابيب رقيقة الجدران. ومع ذلك، توفر الجدران سمكا زيادة الاستقرار والصلابة، والتي يمكن أن تكون مهمة إذا كان غرفة العينة قد تدفق وسائل الإعلام التي يمكن أن تعطل وتحريك أنبوب رفيع. بالنسبة للعينات الأكبر حجما، يمكن استخدام 1.6 × 2.4 مم و2 × 3 مم.
تبادل درجات الحرارة والغاز
الجانب الأساسي لرفاه جنين حمار وحشي هو درجة الحرارة. من الناحية المثالية، حافظ على الأسماك عند 28.5 درجة مئوية أثناء التصوير، حيث تؤثر درجة حرارة البيئة على التنمية ومعدل ضربات القلب34.
في تجربتنا، وتبادل الأكسجين من خلال المكونات agarose 2٪ يحافظ فقط على معدل ضربات القلب مستقرة حتى 3-4 dpf. لذلك، قطع ثقوب في الأنبوب يضمن نشر الأكسجين. ويمكن أيضا أن يكون ضروريا لتسليم المخدرات إلى العينة إذا رغبت في ذلك.
تعليق ضربات القلب.
تسمح سرعات الاستحواذ السريعة للمجاهر ذات الصفائح الضوئية المجهزة بشكل مناسب بتسجيل القلب النابض في الجسم الحي. ومع ذلك، للحصول على كومة ض دون عائق، يمكن للمرء أن يبطئ أو وقف القلب. ومع ذلك، فإن إيقاف القلب يؤدي إلى استرخاء عضلة القلب وقد يؤدي إلى انهيار القلب6. يمكن أن يتم تعليق ضربات القلب باستخدام مورفولينوس، وانخفاض درجات الحرارة، مثبط تقلص العضلات أو optogenetics. كل هذه الطرق لها عيوبها ويجب تقييمها بعناية لكل تجربة.
حقن 4 نانوغرام من القلب الصامت (سيه) مورفولينو في مرحلة خلية واحدة يمكن أن توقف ضربات القلب عن طريق استهداف tnnt2a الجينات حاسمة لتشكيل الساركومير35. لا يوجد لدى سمك الحمار الوحشي sih نبض قلب ولا يبقى على قيد الحياة إلا حتى 7 dpf ، عندما تبدأ الأجنة في الاعتماد على الدم المتداول للأوكسجين. كما يحركها مورفوجينيسيس القلب من قبل كل من القوى الوراثية والميكاميكولوجية الحيوية36، هذه الأسماك الحالية تشوهات القلب حول 3 dpf.
كما تدفق Ca2 + حساسة لدرجة الحرارة، ودرجة الحرارة يؤثر على معدل ضربات القلب في حمار وحشي الجنين21. وبالتالي، فإن خفض درجة الحرارة في غرفة التصوير يبطئ ضربات القلب. توقف ضربات القلب يتطلب درجات حرارة أقل من 15 درجة مئوية. وبما أن حمار وحشي عادة ما يبقى عند 28.5 درجة مئوية، لا يمكن الحفاظ على درجات الحرارة المنخفضة هذه إلا لفترات قصيرة (أقل من 10 دقائق).
يمكن إضافة أدوية مثل المثبطات الكيميائية لتقلصات العضلات ، 2،3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM) ، إلى وسائط حمار وحشي (50 nM37،38) لتعليق ضربات القلب مؤقتا. BDM مريحة للاستخدام لأنه يوقف تقلص القلب في أقل من 15 دقيقة، ويمكن غسلها بعيدا لاستعادة وظيفة القلب. ومع ذلك ، كما BDM يغير إمكانات العمل القلبي ، يجب استخدامه بحذر37.
وأخيرا، يمكن التلاعب بقلب سمك الحمار الوحشي المعدل وراثيا الذي يعبر عن قنوات أو مضخات أيونية ذات بوابات خفيفة مثل القناة أو الهالورهودوبسين في عضلة القلب وإيقافه عن طريق إضاءة جهاز تنظيم ضربات القلب في مسار التدفق بالضوء39,7,40,41,9.
توقعات
تتيح الأدوات والحلول المحسنة المقدمة لدراسة قلب الحمار الوحشي في الجسم الحي التصوير الطويل الأمد واللطيف لديناميكيات القلب فائقة السرعة. ويمكن تكييف تضمين العينة ليناسب طرائق التصوير المختلفة، مثل المجهر البؤري، أو المجهر ثنائي الفوتون، أو التصوير المقطعي الإسقاط البصري (OPT). ومع ذلك، من المرجح أن يكون المجهر الضوئي هو التقنية المفضلة التي توفر تقسيما بصريا بسرعة كافية لالتقاط ديناميكيات القلب. في حين أن هذا البروتوكول يركز على تصوير القلب الجنيني حمار وحشي، ونحن نعتقد أنه يمكن أيضا أن تطبق على عينات وتجارب أخرى مختلفة. سيكون من المثير للاهتمام أن نرى في المستقبل ما إذا كان يمكن استخدام تقنيات التضمين والتصوير المماثلة في مراحل لاحقة أثناء التطوير عندما يكون القلب أكثر إخفاء واليرقة أقل شفافة.
The authors have nothing to disclose.
نشكر مادلين نيوفيلد على التوضيح في الشكل 2h. وقد دعم هذا العمل كل من جمعية ماكس بلانك، ومعهد مورغريدج للبحوث، ومبادرة تشان زوكربيرغ، وبرنامج علوم الحدود البشرية.
1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
E3 medium for zebrafish embryos | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |