Studio dello sviluppo delle cellule dendritiche mediante knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in una linea cellulare ematopoietica e progenitrice in vitro
Summary
Qui forniamo un protocollo per lo screening di potenziali fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo di cellule dendritiche (DC) utilizzando la trasduzione lentivirale di shRNA per ottenere linee cellulari di knockdown stabili per la differenziazione DC in vitro .
Abstract
Le cellule dendritiche (DC) sono importanti cellule che presentano l’antigene che collegano le risposte immunitarie innate e adattative. I DC sono eterogenei e possono essere suddivisi in DC convenzionali (cDC) e DC plasmacitoidi (pDC). cDCs è specializzata nella presentazione di antigeni e attivare cellule T naïve. D’altra parte, i pDC possono produrre grandi quantità di interferoni di tipo I (IFN-I) durante l’infezione virale. La specifica delle DC si verifica in una fase iniziale dei progenitori DC nel midollo osseo (BM) ed è definita da una rete di fattori di trascrizione (TF). Ad esempio, i cDC esprimono altamente ID2, mentre i pDC esprimono altamente E2-2. Poiché vengono identificati sempre più sottoinsiemi di DC, c’è un crescente interesse per la comprensione di specifici TF che controllano lo sviluppo DC. Qui, stabiliamo un metodo per lo screening dei TF critici per la differenziazione delle DC in vitro consegnando lentivirus che trasporta RNA a forcina corta (shRNA) in una linea immortalizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (iHSPC). Dopo la selezione e la differenziazione in vitro , il potenziale cDC e pDC delle linee cellulari stabili di knockdown viene analizzato mediante citometria a flusso. Questo approccio fornisce una piattaforma per identificare i geni che potenzialmente governano i destini della DC dai progenitori in vitro.
Introduction
I DC sono regolatori chiave dell’immunità innata e adattativa1. I DC sono principalmente classificati in due popolazioni funzionalmente distinte, vale a dire pDC e cDC. Inoltre, i cDC comprendono due sottoinsiemi, vale a dire, rispettivamente, cDC di tipo I e di tipo II o cDC1 e cDC22. Le pDC, che esprimono BST2, Siglec-H e livelli intermedi di CD11c nei topi3,4, sono le cellule che possono secernere grandi quantità di IFN-I durante l’infiammazione e l’infezione virale5. Grazie alla loro robusta capacità di produrre IFN-I, si sospetta anche che svolgano un ruolo chiave nella progressione delle malattie autoimmuni, tra cui il lupus eritematoso sistemico (LES)6. I cDC1, definiti dall’espressione superficiale di XCR1, CD8a, CLEC9A e CD103 nei topi7, sono specializzati nell’attivazione e polarizzazione delle cellule T CD8+ citotossiche (CTL) attraverso la presentazione incrociata dell’antigene, avviando così l’immunità di tipo I in risposta a patogeni intracellulari e cancro8,9. D’altra parte, i cDC2, che esprimono CD11b e CD172α (noto anche come Sirpα) sia nell’uomo che nei topi, possono attivare le cellule T CD4 + e promuovere la risposta immunitaria di tipo II contro allergeni e parassiti10, oltre a modulare l’immunità di tipo III a seguito di batteri extracellulari e riconoscimento del microbiota11,12.
La diversificazione delle DC è determinata da un gruppo di TF da cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) nel BM. E2-2 (codificato da Tcf4) è un regolatore principale per la differenziazione e la funzione dei pDC13,14. Al contrario, l’inibitore del legame del DNA 2 (ID2) guida la specifica cDC e inibisce lo sviluppo di pDC bloccando l’attività della proteina E15. Inoltre, lo sviluppo di cDC1 richiede IRF8 e BATF3, mentre la differenziazione di cDC2 dipende fortemente da IRF416. Lavori recenti hanno esplorato l’eterogeneità dei pDC17 e dei cDC e la loro regolazione trascrizionale18. A causa della complessità della rete DC, vi è una necessità insoddisfatta di stabilire una piattaforma per identificare altri TF che controllano lo sviluppo e la funzionalità dei DC.
Qui, abbiamo usato un iHSPC che è stato generato esprimendo la traslocazione nucleare regolata dagli estrogeni di Hoxb8 nelle cellule BM (note anche come cellule Hoxb8-FL)19. Le iHSPC possono proliferare e rimanere in uno stadio indifferenziato in presenza di β-estradiolo e ligando Flt3 (FL), mentre iniziano a differenziarsi in diversi tipi di DC in presenza di FL al momento del ritiro di β-estradiolo19. Sulla base di questa caratteristica, possiamo abbattere i geni di interesse nella fase progenitrice, seguita dall’esame dell’effetto sulla differenziazione in vitro di pDC e cDC. Pertanto, questo metodo è un potente strumento per scoprire i geni che regolano lo sviluppo e la funzione dei DC.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vettori shRNA basati su lentivirus sono spesso utilizzati per il silenziamento genico mediante trasduzione virale nelle cellule e consentono un’integrazione stabile nel genoma dell’ospite. Tuttavia, è necessario considerare varie efficienza di trasduzione in diversi tipi di cellule e sono stati adottati numerosi approcci per superare questo problema.
Polybrene è un polimero policanico in grado di neutralizzare le cariche sulla membrana cellulare, migliorando così il legame del virione al…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per il supporto tecnico del Dr. Tz-Ling Chen. Ringraziamo la National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) per aver fornito shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 e MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
Riferimenti
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