Исследование развития дендритных клеток с помощью короткого шпильки РНК-опосредованного нокдауна гена в кроветворном стволе и клеточной линии-предшественника in vitro
Summary
Здесь мы предоставляем протокол для скрининга потенциальных факторов транскрипции, участвующих в развитии дендритных клеток (DC), с использованием лентивирусной трансдукции шРНК для получения стабильных нокдаун клеточных линий для дифференцировки dc in vitro .
Abstract
Дендритные клетки (ДК) являются важными антигенпрезентирующими клетками, которые связывают врожденные и адаптивные иммунные реакции. ДК неоднородны и могут быть разделены на обычные ДК (кДК) и плазмоцитоидные ДК (пДК). cDCs специализируется на представлении антигенов и активации наивных Т-клеток. С другой стороны, pDC могут производить большое количество интерферонов типа I (IFN-I) во время вирусной инфекции. Спецификация ДК происходит на ранней стадии предшественников ДК в костном мозге (БМ) и определяется сетью факторов транскрипции (ТФ). Например, кДК высоко экспрессируют ID2, в то время как pDC высоко экспрессируют E2-2. Поскольку выявляется все больше и больше подмножеств РС, растет интерес к пониманию конкретных ТФ, контролирующих разработку ЦОД. Здесь мы устанавливаем метод скрининга ТФ, критически важных для дифференцировки ДК in vitro , путем доставки лентивируса, несущего короткую шпильку РНК (шРНК), в увековеченную линию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (iHSPC). После селекции и дифференцировки in vitro с помощью проточной цитометрии анализируются потенциал cDC и pDC стабильных нокдаун клеточных линий. Этот подход обеспечивает платформу для идентификации генов, потенциально управляющих судьбами DC от прародителей in vitro.
Introduction
РС являются ключевыми регуляторами врожденного и адаптивного иммунитета1. РС в основном классифицируются на две функционально различные популяции, а именно pDC и cDC. Кроме того, кДК включают два подмножества, а именно кДК типа I и типа II или cDC1 и cDC2, соответственно2. pDCs, экспрессирующие BST2, Siglec-H и промежуточные уровни CD11c у мышей3,4, являются клетками, которые могут секретировать большое количество IFN-I во время воспаления и вирусной инфекции5. Благодаря своей надежной способности производить IFN-I, они также подозреваются в том, что они играют ключевую роль в прогрессировании аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку (СКВ)6. cDC1s, определяемые поверхностной экспрессией XCR1, CD8a, CLEC9A и CD103 у мышей7, специализируются на активации и поляризации цитотоксических CD8+ Т-клеток (CTL) через перекрестную презентацию антигена, тем самым инициируя иммунитет типа I в ответ на внутриклеточные патогены и рак8,9. С другой стороны, cDC2s, экспрессирующие CD11b и CD172α (также известные как Sirpα) как у людей, так и у мышей, могут активировать CD4 + Т-клетки и способствовать иммунному ответу типа II против аллергена и паразитов10, а также модулировать иммунитет типа III после распознавания внеклеточных бактерий и микробиоты11,12.
Диверсификация ДК определяется группой ТФ из гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСПЦ) в БМ. Е2-2 (кодируется Tcf4) является главным регулятором дифференцировки и функции пДК13,14. Напротив, ингибитор связывания ДНК 2 (ID2) управляет спецификацией cDC и ингибирует развитие pDC путем блокирования активности белка E15. Кроме того, разработка cDC1 требует IRF8 и BATF3, в то время как дифференциация cDC2 сильно зависит от IRF416. Недавние работы исследовали гетерогенность pDC17 и cDC и их транскрипционное регулирование18. Из-за сложности сети контроллеров домена существует неудовлетворенная потребность в создании платформы для идентификации других TF, контролирующих разработку и функциональность DC.
Здесь мы использовали iHSPC, который был получен путем экспрессии эстроген-регулируемой ядерной транслокации Hoxb8 в клетках BM (также называемых клетками Hoxb8-FL)19. iHSPC могут размножаться и оставаться в недифференцированной стадии в присутствии β-эстрадиола и лиганда Flt3 (FL), тогда как они начинают дифференцироваться на различные типы DC в присутствии FL при отмене β-эстрадиола19. Основываясь на этой особенности, мы можем сбить гены, представляющие интерес на стадии прародителя, с последующим изучением влияния на дифференцировку pDC и cDC in vitro. Таким образом, этот метод является мощным инструментом для обнаружения генов, которые регулируют развитие и функцию DC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Векторы шРНК на основе лентивируса часто используются для глушения генов путем вирусной трансдукции в клетки и обеспечивают стабильную интеграцию в геном хозяина. Тем не менее, необходимо учитывать различную эффективность трансдукции в разных типах клеток, и для преодоления этой про?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за техническую поддержку д-ру Ц-Лин Чену. Мы благодарим Национальный основной фонд RNAi (Academia Sinica, Тайвань) за предоставление дРНК-лентивируса (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 и MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
Riferimenti
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
- Liu, Y. -. J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
- Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
- Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
- Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
- Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
- Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
- Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
- Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
- Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
- Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
- Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
- Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
