Étude du développement de cellules dendritiques par knockdown de gènes médiés par l’ARN en épingle à cheveux court dans une lignée cellulaire hématopoïétique et progénitrice in vitro
Summary
Nous fournissons ici un protocole pour le dépistage des facteurs de transcription potentiels impliqués dans le développement de cellules dendritiques (DC) en utilisant la transduction lentivirale de l’ARNh pour obtenir des lignées cellulaires knockdown stables pour la différenciation DC in vitro .
Abstract
Les cellules dendritiques (DC) sont d’importantes cellules présentatrices d’antigènes qui relient les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les DC sont hétérogènes et peuvent être divisés en DC conventionnels (cDC) et en DC plasmocytoïdes (pDC). cDCs se spécialise dans la présentation d’antigènes et l’activation de lymphocytes T naïfs. D’autre part, les pDC peuvent produire de grandes quantités d’interférons de type I (IFN-I) lors d’une infection virale. La spécification des DC se produit à un stade précoce des progéniteurs DC dans la moelle osseuse (BM) et est définie par un réseau de facteurs de transcription (TF). Par exemple, les cDC expriment fortement ID2, tandis que les pDC expriment fortement E2-2. Étant donné que de plus en plus de sous-ensembles de DC sont identifiés, il existe un intérêt croissant pour la compréhension de TF spécifiques contrôlant le développement de DC. Ici, nous établissons une méthode pour dépister les TF critiques pour la différenciation des DC in vitro en délivrant un lentivirus porteur d’ARN en épingle à cheveux court (shRNA) dans une lignée de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées (iHSPC). Après la sélection et la différenciation in vitro , le potentiel cDC et pDC des lignées cellulaires stables est analysé par cytométrie en flux. Cette approche fournit une plate-forme pour identifier les gènes potentiellement régissant le destin des DC des progéniteurs in vitro.
Introduction
Les DC sont des régulateurs clés de l’immunité innée et adaptative1. Les PAYS sont principalement classés en deux populations fonctionnellement distinctes, à savoir les PDC et les CDC. En outre, les CDC comprennent deux sous-ensembles, à savoir les CDC de type I et de type II ou cDC1 et cDC2, respectivement2. Les pDC, exprimant BST2, Siglec-H et des niveaux intermédiaires de CD11c chez la souris3,4, sont les cellules qui peuvent sécréter de grandes quantités d’IFN-I lors de l’inflammation et de l’infection virale5. En raison de leur capacité robuste à produire des IFN-I, ils sont également soupçonnés de jouer un rôle clé dans la progression des maladies auto-immunes, y compris le lupus érythémateux disséminé (LED)6. Les cDC1, définis par l’expression de surface de XCR1, CD8a, CLEC9A et CD103 chez la souris7, sont spécialisés dans l’activation et la polarisation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) par la présentation croisée de l’antigène, initiant ainsi une immunité de type I en réponse aux agents pathogènes intracellulaires et au cancer8,9. D’autre part, les cDC2, exprimant CD11b et CD172α (également connus sous le nom de Sirpα) chez l’homme et la souris, peuvent activer les lymphocytes T CD4+ et favoriser la réponse immunitaire de type II contre les allergènes et les parasites10, ainsi que moduler l’immunité de type III après la reconnaissance des bactéries extracellulaires et du microbiote11,12.
La diversification des DC est déterminée par un groupe de TF à partir de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) dans le BM. E2-2 (codé par Tcf4) est un régulateur maître pour la différenciation et la fonction des pDC13,14. En revanche, l’inhibiteur de la liaison à l’ADN 2 (ID2) détermine la spécification du cDC et inhibe le développement du pDC en bloquant l’activité de la protéine E15. De plus, le développement des cDC1 nécessite IRF8 et BATF3, tandis que la différenciation des cDC2 dépend fortement de l’IRF416. Des travaux récents ont exploré l’hétérogénéité des pDC17 et des cDC et leur régulation transcriptionnelle18. En raison de la complexité du réseau CC, il existe un besoin non satisfait d’établir une plate-forme pour identifier d’autres TF contrôlant le développement et la fonctionnalité des DC.
Ici, nous avons utilisé un iHSPC qui a été généré en exprimant la translocation nucléaire régulée par les œstrogènes de Hoxb8 dans les cellules BM (également appelées cellules Hoxb8-FL)19. Les iHSPC peuvent proliférer et rester dans un stade indifférencié en présence de β-estradiol et de ligand Flt3 (FL), alors qu’ils commencent à se différencier en différents types DC en présence de FL lors du retrait du β-estradiol19. Sur la base de cette caractéristique, nous pouvons détruire les gènes d’intérêt au stade progéniteur, puis examiner l’effet sur la différenciation in vitro des pDC et des cDC. Par conséquent, cette méthode est un outil puissant pour découvrir les gènes qui régulent le développement et la fonction des DC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les vecteurs shRNA à base de lentivirus sont souvent utilisés pour le silençage génique par transduction virale dans les cellules et permettent une intégration stable dans le génome de l’hôte. Cependant, diverses efficacités de transduction dans différents types de cellules doivent être prises en compte, et un certain nombre d’approches ont été adoptées pour surmonter ce problème.
Le polybrène est un polymère polycationique qui peut neutraliser les charges sur la membrane …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants du soutien technique du Dr Tz-Ling Chen. Nous remercions le National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taïwan) d’avoir fourni le lentivirus shRNA (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 et MOST 109-2320-B-002-054-MY3).
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
Riferimenti
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