Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

La terapia génica que utiliza vectores de virus adenoasociados (AAV) ha logrado grandes avances en las últimas tres décadas^1,2. Las mejoras demostradas en una amplia gama de enfermedades genéticas, incluida la ceguera congénita, la hemofilia y las enfermedades del sistema musculoesquelético y nervioso central, han llevado la terapia génica AAV a la vanguardia de la investigación clínica^3,4. En 2012, la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) aprobó Glybera, un vector AAV1 que expresa lipoproteína lipasa (LPL) para el tratamiento de la deficiencia de LPL, lo que la convierte en la primera autorización de comercialización para un tratamiento de terapia génica en Europa o estados Unidos⁵. Desde entonces, dos terapias génicas AAV adicionales, Luxturna⁶ y Zolgensma^7,han recibido la aprobación de la FDA, y se espera que el mercado se expanda rápidamente en los próximos 5 años con hasta 10-20 terapias génicas esperadas para 2025⁸. Los datos clínicos disponibles indican que la terapia génica AAV es una modalidad segura, bien tolerada y eficaz, lo que la convierte en uno de los vectores virales más prometedores, con más de 244 ensayos clínicos con AAV registrados con ClinicalTrials.gov. El creciente interés en las aplicaciones clínicas que involucran vectores AAV requiere métodos de producción robustos y escalables para facilitar la evaluación de las terapias AAV en modelos animales grandes, ya que este es un paso crítico en la tubería traslacional⁹.

Para la producción de vectores AAV, los dos requisitos principales son el genoma AAV y la cápside. El genoma de tipo salvaje (wt)-AAV es ADN monocatenario que tiene aproximadamente 4,7 kb de longitud^10. El genoma wt-AAV comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) que se encuentran en ambos extremos del genoma, que son importantes para el empaquetado, y los genes rep y cap ¹¹. Los genes rep y cap, necesarios para la replicación del genoma, el ensamblaje de la cápside viral y la encapsulación del genoma en la cápside viral, se eliminan del genoma viral y se proporcionan en trans para la producción de vectores AAV¹². La eliminación de estos genes del genoma viral proporciona espacio para transgenes terapéuticos y todos los elementos reguladores necesarios, incluidos el promotor y la señal de poliA. Los RTI permanecen en el genoma del vector para garantizar la replicación adecuada del genoma y la encapsulación viral^13,14. Para mejorar la cinética de la expresión transgénica, los genomas vectoriales AAV pueden diseñarse para ser autocomplementarios, lo que mitiga la necesidad de conversión de ADN de cadena simple a doble cadena durante la replicación del genoma AAV, pero reduce la capacidad de codificación a ~ 2.4 kb¹⁵.

Más allá del diseño del genoma AAV, la selección del serotipo de la cápside determina el tropismo tisular y celular del vector AAV in vivo². Además del tropismo tisular, se ha demostrado que diferentes serotipos de AAV muestran diferentes cinéticas de expresión^{génica 16}. Por ejemplo, Zincarelli et al.¹⁷ clasificaron diferentes serotipos de AAV en serotipos de baja expresión (AAV2, 3, 4, 5), serotipos de expresión moderada (AAV1, 6, 8) y serotipos de alta expresión (AAV7 y 9). También clasificaron los serotipos de AAV en expresión de inicio lento (AAV2, 3, 4, 5) o expresión de inicio rápido (AAV1, 6, 7, 8 y 9). Estos tropismos divergentes y la cinética de expresión génica se deben a variaciones de aminoácidos en las proteínas de la cápside, formaciones de proteínas de la cápside e interacciones con los receptores/co-receptores de la célula huésped¹⁸. Algunas cápsides AAV tienen características beneficiosas adicionales, como la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica después de la administración intravascular (AAV9) o residen en células musculares de larga vida para una expresión transgénica duradera (AAV6, 6.2FF, 8 y 9)^19,20.

Este artículo tiene como objetivo detallar un método rentable para producir vectores AAV de alta pureza, alto título y grado de investigación para su uso en modelos preclínicos de animales grandes. La producción de AAV utilizando este protocolo se logra utilizando la transfección de doble plásmido en células adherentes de riñón embrionario humano (HEK)293 cultivadas en pilas celulares. Además, el estudio describe un protocolo para la purificación por cromatografía de afinidad de sulfato de heparina, que se puede utilizar para serotipos AAV que contienen dominios de unión a heparina, incluidos AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 y DJ^21,22.

Hay varios sistemas de envasado disponibles para la producción de vectores AAV. Entre estos, el uso de un sistema de coinfección de dos plásmidos, en el que los genes Rep y Cap y los genes auxiliares de Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 y ARN VA) están contenidos dentro de un plásmido (pHelper), tiene algunas ventajas prácticas sobre el método común de transfección de tres plásmidos (triple), incluido el costo reducido para la producción de plásmidos^23,24 . El plásmido del genoma AAV que contiene el casete de expresión transgénica (pTransgene), debe estar flanqueado por RTI, y no debe exceder ~ 4.7 kb de longitud. El título y la pureza del vector pueden verse afectados por el transgén debido a los posibles efectos citotóxicos durante la transfección. La evaluación de la pureza del vector se describe en este documento. Los vectores producidos utilizando este método, que producen un 1 x 10¹³ vg / ml para cada uno, se evaluaron en ratones, hámsteres y modelos animales ovinos.

Tabla 1: Composición de las soluciones requeridas. Información necesaria, incluidos porcentajes y volúmenes, de los componentes necesarios para diversas soluciones a lo largo del protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.