الدماغ بيريسيت الكالسيوم والتصوير الدموي في الفئران المعدلة وراثيا في فيفو
Summary
يقدم هذا البروتوكول خطوات للحصول على صور الكالسيوم الفلورية وتحليلها من بيريسيتات الورث الدماغي وبيانات تدفق الدم من الأوعية الدموية القريبة في الفئران المخدرة. هذه التقنيات مفيدة لدراسات فسيولوجيا الخلايا الجدارية ويمكن تكييفها للتحقيق في عابري الكالسيوم في أي نوع من الخلايا.
Abstract
وقد جعلت التطورات الأخيرة في بيولوجيا البروتين وعلم الوراثة الماوس من الممكن لقياس تقلبات الكالسيوم داخل الخلايا من خلايا الدماغ في الجسم الحي وربط هذا مع الديناميكا الدموية المحلية. يستخدم هذا البروتوكول الفئران المعدلة وراثيا التي تم إعدادها مع نافذة الجمجمة المزمنة والتعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا، RCaMP1.07، تحت α الملساء العضلات actin المروج لتسمية الخلايا الجدارية على وجه التحديد، مثل خلايا العضلات الملساء الأوعية الدموية وingsheathing pericytes. وترد خطوات حول كيفية إعداد قسطرة الوريد الذيل للحقن الوريدي من الأصباغ الفلورية لتتبع تدفق الدم، فضلا عن كيفية قياس الكالسيوم بيريسيت الدماغ والديناميكا الدموية الأوعية الدموية المحلية (القطر، وسرعة خلايا الدم الحمراء، وما إلى ذلك) من قبل اثنين من المجهر الفوتون في الجسم الحي من خلال النافذة القحفية في الفئران مخدر الكيتامين / xylazine. وأخيرا، يتم توفير تفاصيل لتحليل تقلبات الكالسيوم وأفلام تدفق الدم عبر خوارزميات معالجة الصور التي وضعها باريت وآخرون 2018، مع التركيز على كيفية تكييف هذه العمليات مع بيانات التصوير الخلوي الأخرى.
Introduction
الجهاز العصبي المركزي الأوعية الدموية يتكون من اختراق الشرايين، الشعيرات الدموية، والفينولا الصاعدة. داخل هذه الشبكة، تقوم الخلايا الجدارية مثل خلايا العضلات الملساء الوعائية بتغليف الشرايين والبيريسيات بتوسيع العمليات الخلوية على طول فروع الشرايين الأولى والشعيرات الدموية1. بيريسيتس ويبدو أن لها عدة أدوار داخل الدماغ بما في ذلك الحفاظ على الدم الدماغ حاجز1,2,الهجرة والحركة3, خصائص الخلايا الجذعية المحتملة, وتنظيم تدفق الدم في الدماغ4,5,6. وقد تم ربط العديد من الأدوار الوظيفية للبيريسيت إلى تقلبات في الكالسيوم داخل الخلايا التي قد تنظم تمدد أو انكماش هذه الخلايا4,5,6.
وقد وضعت العديد من الدراسات الحديثة معايير لتحديد أنواع مختلفة من pericytes الدماغ7,8. الخلايا الجدارية داخل الفروع 4 الأولى من اختراق الشرايين هي ensheathing pericytes على أساس تعبيرهم عن البروتين الانكماشي α السلس العضلات أكتين (αSMA) وتبرز بهم, سوماتا ovoid مع العمليات التي تلتف حول الأوعية7,8,9. لتصور تقلبات الكالسيوم في البيريسيت ensheathing، يستخدم هذا البروتوكول خط الماوس المعدلة وراثيا رواية، Acta2-RCaMP1.07، المعروف أيضا باسم TG(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. هذه الفئران تعبر عن مؤشر الكالسيوم الأحمر المشفرة وراثيا، RCaMP1.07، في αSMA التعبير عن الخلايا (خلايا العضلات الملساء الأوعية الدموية وpercytes ensheathing). يتم الحفاظ على مستعمرات التربية عن طريق عبور الحيوانات غير الحاملة مع الهيميزيغات. RCaMP1.07 هو بروتين فلوري أحمر مع مجال ربط كالمودولين ، مما يزيد من الفلورسنت عند ربط الكالسيوم داخل الخلايا10،11. يحدد هذا البروتوكول خطوات التصوير بالكالسيوم المشترك لمخلفات البيريسيت وقياسات تدفق الدم من خلال مجهرين فوتونين بما في ذلك إجراءات حقن الوريد الذيل للأصباغ الفلورية ، واكتساب صورة المجهر في الفئران المخدرة ، وتحليل البيانات مع منصات البرمجة(الشكل 1). هذه التقنيات مفيدة لمعالجة الأسئلة حول فسيولوجيا الخلايا الجدارية ولكن يمكن تكييفها لدراسة عابري الكالسيوم في أي نوع من الخلايا في الدماغ أو نظام الأعضاء الأخرى.
تم استخدام فأرة Acta2-RCaMP1.07 البالغة من العمر 10 أشهر للتجربة المعروضة في هذه المقالة. خضع الفأر لعملية جراحية لنافذة الجمجمة المزمنة وزرع الرأس بعد شهرين. تفاصيل البروتوكول الجراحي تناقش في الدراسات السابقة12و13 وتم تنفيذ إجراءات مماثلة في بروتوكولات أخرى نشرت سابقا14و15. تم تسمية الأوعية الدموية بالفلورسين الأخضر -Dextran (70،000 ميجاوات ، محلول أنيوني ، 2.5٪ ث / v) تم حقنه عن طريق الوريد. هذه الصبغة فعالة من حيث التكلفة ومتاحة بسهولة من المصادر التجارية ، ولكن لديها طيف انبعاثات أوسع قد تتداخل مع انبعاثات RCaMP وتنزف خلال اكتساب صورة المجهر. وترد الخطوات اللازمة للتمثيل الطيفي في القسم 4 أدناه للتحايل على ذلك، ولكن يمكن أيضا استخدام الأصباغ الخضراء الأخرى ذات أطياف الانبعاثات الأضيق، مثل تلك القائمة على EGFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الحالية توفر تفاصيل عن الماوس حقن الوريد الذيل مع القسطرة، واثنين من الفوتونات صورة مجهر اقتناء لمداخن العمق، والخلايا الأفلام إشارات الكالسيوم، وخلق kymographs الهمودية، وتحليل الكالسيوم والهيوم الديناميكي مع خوارزميات معالجة الصور لدينا17 (الشكل 1). هناك العديد من المزايا لهذه التقنيات التي تحسن نتيجة التصوير في الجسم الحي وتقلل من الوقت والموارد والإجهاد الحيواني خلال الدورة. أولا، استخدام القسطرة لحقن الوريد الذيل يوفر المزيد من السيطرة على الإبرة والمحاقن وكمية المادة التي يتم حقنها في الدورة الدموية للفأر. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمنع حقن صبغ في أنسجة الذيل، وتوفير الكواشف باهظة الثمن. ثانيا، نستخدم الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن أجهزة استشعار الكالسيوم المشفرة وراثيا في إعادة بث البيريسيت وإظهار كيفية توطينها داخل شبكة الأوعية الدموية في الدماغ مع عمق z-stack، مما يسهل تحديد الخلايا ونقلها في جلسات التصوير اللاحقة على المدى الطويل. هذا عامل مهم في دراسات بيريسيت ويضمن تصنيف الخلايا السليم6،7. ثالثا، نحن نقدم معلماتنا لجمع أفلام الكالسيوم وبيانات مسح الخط الديناميكي الدموي التي تشكل نقطة انطلاق جيدة لقياس الإشارات الخلوية الديناميكية. وأخيرا ، نقدم خوارزميات معالجة الصور17، صندوق أدوات معالجة الصور الشامل الذي يحتوي على نهج متعددة للمعالجة المسبقة للصورة (مثل التمليس الطيفي) ، وتحليل صورة الكالسيوم ، وتحليل ديناميكية الدم (القطر والسرعة وما إلى ذلك). يمكن لهذه الخوارزميات توليد مؤامرات لتصور سريع وسهل للبيانات ، مع تقليل مستوى خبرة المستخدم المطلوبة لتحليل النتائج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الآلي مع بضعة أسطر من التعليمات البرمجية لعملية بسرعة مجموعات بيانات متعددة مع نفس المعلمات. وهذا يمكن أن يحسن تصور البيانات واستثمار الوقت للباحث.
المفتاح لجمع بيانات جيدة لتصوير الكالسيوم هو ضبط طاقة الليزر وإعدادات PMT للحصول على إشارة مضان واضحة ، ولكن أيضا جمع البيانات بمعدل إطار كاف لالتقاط حدث الكالسيوم بأكمله. تم الحصول على البيانات الواردة في هذا البروتوكول بمعدل 10-11 إطارا في الثانية ، مما يلتقط ذبذبات الكالسيوم الأبطأ في إعادة التكسير. وهناك أيضا عدة خطوات أثناء التحليل يمكن أن تحسن نتائج التحليل. أولا، يكون التمسيد الطيفي مفيدا إذا كان هناك تداخل كبير بين أطياف الانبعاثات للفلوروفوريس(الشكل 2). تم استخدام فلورسين-ديكتران في هذا البروتوكول لأنه قابل للتكرار فعال من حيث التكلفة ومتاح تجاريا يستخدم عادة لقياسات الديناميكا الدموية5. ويساعد الطيز الطيفي على تنظيف البيانات من أجل تحسين الكشف عن إشارات الكالسيوم، ولكن يمكن أيضا استخدام الفلوروفوريس البديلة ذات أطياف الانبعاثات الأضيق. ثانيا، اختيار الهياكل الخلوية ك ROIs(الشكل 3)مفيد لتصنيف أحداث الكالسيوم في مناطق فرعية مختلفة مثل سوما أو فروع العملية. يوفر اختيار عائد الاستثمار القائم على النشاط (الشكل 4)16 المزيد من المعلومات المكانية والزمانية حول أحداث الكالسيوم الفردية. وهذا يمكن أن يكون مفيدا عند تحديد وتيرة أحداث الكالسيوم في منطقة معينة أو نشر الأحداث إلى مناطق خلوية أخرى. يمكن أن يوفر استخدام برامج البرمجة لتحليل بيانات التصوير على الباحثين ساعات من الوقت عند معالجة البيانات دفعة واحدة ، ولكنه يتطلب بعض الاستثمار في الوقت الأولي لضبط المعلمات لتحقيق أفضل النتائج. وأهم العوامل هي الحجم المتوقع (في μm2)للمنطقة النشطة وكذلك مدة الإشارة (يجب تحديد الحد الأدنى لوقت الإشارة والحد الأقصى لوقت الإشارة). يجب على الباحثين فحص بعض الأفلام تي سلسلة المثال أولا لتحديد أفضل المعايير التي تناسب بياناتها. وأخيرا، فإن البيانات ذات النوعية الرديئة التي يتم الحصول عليها على المجهر يمكن أن تعيق إلى حد كبير تحليل الكالسيوم والديناميكا الدموية(الشكل 6). لذلك ، يجب توخي الحذر لتحسين إعدادات اكتساب المجهر في البداية. مع وضع هذه العوامل في الاعتبار، فإن هذا البروتوكول الذي يمكن تكييفه ليناسب تصوير الكالسيوم أو تحليل الإشارات الخلوية الديناميكية الأخرى (مثل الصوديوم الفلوري أو البوتاسيوم أو المستقلب أو تقلبات الجهد) في الأنسجة أو أنواع الخلايا الأخرى.
هناك العديد من القيود على هذا البروتوكول. أولا، يتم جمع البيانات تحت التخدير، مما يؤثر على نشاط الدماغ ويمكن أن يؤثر على تدفق الدم. ويمكن إجراء تصوير مماثل في الفئران مستيقظا التي يتم تدريبها على قبول تثبيت الرأس لمزيد من النتائج الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن نتذكر أن نجمع صور ثنائية الأبعاد لخلية ثلاثية الأبعاد ووعاء دموي في الجسم الحي. لذلك، يمكننا التقاط فصيل فقط من أحداث الكالسيوم داخل هذه الخلايا أو تدفق الدم في قسم واحد من الأوعية الدموية في وقت واحد.
وهناك قيد آخر يجب ملاحظته هو أن تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون حساس للقطع الأثرية للحركة ، حيث يمكن أن يكون التنقل داخل وخارج المستوى البؤري مخطئا بسبب تقلبات الكالسيوم. تم تنفيذ هذا البروتوكول تحت التخدير ، مما يحد من حركة الحيوان . ومع ذلك ، يمكن إدخال القطع الأثرية الحركة عن طريق معدل التنفس من الماوس ، ومعدل ضربات القلب ، وتورم الأنسجة المحتملة ، وفي حالة النفخ pericytes ، تقلص الأوعية أو vasomotion 4،6،18،19. يمكن التخفيف من القطع الأثرية الحركة من خلال عدة استراتيجيات. تتضمن حزم معالجة الصور المستخدمة في هذا البروتوكول خطوة تصحيح الحركة الاختيارية ، والتي تستخدم محركا ملتويا ثلاثي الأبعاد لمحاذاة الصور داخل السلسلة T استنادا إلى الأوعية الدمويةالمرئية 13و17. يتم تحديد الإطارات ذات التغيرات الهامة في المستوى البؤري بواسطة هذه الخوارزمية ويمكن استبعادها من التحليل. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن استخدام استراتيجيات إحصائية داخل حزم معالجة التصوير، مثل درجة Z عند توليد آثار مضان لتطبيع الحركة الناجمة عن تقلبات الكالسيوم20. النهج الأكثر قوة لحساب القطع الأثرية الحركة في التصوير اثنين الفوتون هو الجمع بين التعبير عن اثنين من المؤشرات الفلورية داخل نفس الخلية، مثل مؤشر الكالسيوم (على سبيل المثال، GCaMP) ومراسل الفلورسنت (على سبيل المثال، mCherry) التي هي مستقلة عن الكالسيوم. ويمكن بعد ذلك أن تعزى التقلبات في المراسل الفلوري إلى الحركة ويتم طرحها من إشارة مؤشر الكالسيوم لتطبيع القطع الأثرية للحركة.
الغرض من هذا البروتوكول هو توفير فهم واضح لكيفية جمع أفضل بيانات تصوير الكالسيوم وتدفق الدم في الجسم الحي وتقديم أساليب وأدوات تحليل جديدة يمكن للباحثين تنفيذها من أجل تحسين نتائجهم. ويمكن تطبيق هذه التقنيات لدراسة دور مجموعات مختلفة من البيريسيات في السيطرة على تدفق الدم أو في حالات أمراض الدماغ المختلفة. ويمكن أيضا استخدام معلمات التصوير هذه لدراسة الكالسيوم وتدفق الدم في أنواع الخلايا الأخرى وأنظمة الأعضاء وتنطبق مبادئ مماثلة على تقنيات التصوير الديناميكية الأخرى التي أصبحت ممكنة من خلال أجهزة استشعار أخرى مشفرة وراثيا، تتجاوز الكالسيوم.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Meza مدعومة بزمالات من Mitacs والبحوث مانيتوبا. وقدمت تمويل هذا العمل المعاهد الكندية للبحوث الصحية، والبحوث مانيتوبا، ومؤسسة مانيتوبا للخدمات الطبية، والتمويل الأولي من جامعة مانيتوبا وكندا للدماغ من خلال الصندوق الكندي لبحوث الدماغ، بدعم مالي من وزارة الصحة الكندية ومؤسسة أزريلي. والآراء الواردة هنا لا تمثل بالضرورة آراء وزير الصحة أو حكومة كندا.
Materials
| Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
| Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
| BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
| CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
| Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
| Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
| FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
| Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
| Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
| MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
| Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
| Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
| PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
| Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
| Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
| Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
| Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |
Riferimenti
- Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Berthiaume, A. -. A., et al. Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -. F. F., Charpak, S. Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia. Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Gonzales, A. L., et al. Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).
- Hartmann, D. a., et al. Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice. Neurophotonics. 2 (4), 041402 (2015).
- Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).
- Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes. Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).
- 28345 – STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory Available from: https://www.jax.org/strain/028345 (2021)
- Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials. PLoS ONE. 7 (7), (2012).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. JoVE. (12), e680 (2008).
- Lin, X., et al. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. JoVE. (143), e56297 (2019).
- Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).
- Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis. Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (1), 55-60 (2014).
- Nilsson, H., Aalkjaer, C. Vasomotion: mechanisms and physiological importance. Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).
- Rungta, R. L., et al. Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex. Communications Biology. , (2021).
