Hier presenteren we de mediator release assay, met behulp van een rat basofiele leukemie cellijn getransfecteerd met de menselijke IgE receptor, om de degranulatie van effectorcellen te simuleren die typisch worden waargenomen bij type 1 allergische reacties. Deze methode onderzoekt de biologische activiteit van allergenen op een zeer gevoelige, reproduceerbare en aanpasbare manier.
Mediator release assays analyseren in vitro immunoglobuline E (IgE)-gemedieerde degranulatie en secretie van mediatoren door effectorcellen, zoals mestcellen en basofielen, na stimulatie met seriële verdunningen van vermeende allergenen. Daarom vormen deze testen een essentieel hulpmiddel dat het in vivo degranulatieproces nabootst, dat optreedt bij blootstelling aan allergenen bij gesensibiliseerde patiënten of bij huidpriktests. Bovendien worden deze testen meestal gebruikt om het allergene potentieel van eiwitten en de reactiviteit van de reactiviteit van sera van patiënten te onderzoeken. Hierin beschrijven we een eenvoudig 2-daags protocol met behulp van een vereeuwigde basofiele leukemie cellijn van ratten getransfecteerd en gehistaliseerd met de menselijke IgE plasmamembraanreceptor met hoge affiniteit (FcεRI). Deze variant van de mediator release assay is een robuust, gevoelig en reproduceerbaar in vitro celgebaseerd systeem zonder de noodzaak om het antigeen te immobiliseren tot vaste matrices. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: (1) aanvulling op inactivatie van menselijke sera, (2) oogsten, zaaien en passieve sensibilisatie van de cellen, (3) stimulatie met antigeen om mediatorafgifte te veroorzaken, en (4) meten van β-hexosaminidase-activiteit als surrogaat voor de vrijgegeven ontstekingsmediatoren, zoals histamine. De test is een nuttig hulpmiddel om de capaciteit van het allergeen-IgE-cross-linking te beoordelen om celdegranulatie te activeren en kan worden geïmplementeerd om allergeenextracten te standaardiseren, om de reactiviteit van patiënten op kleine of belangrijke allergenen en op allergene extracten (pollen, huidschilfers van katten, enz.) te vergelijken, om de potentie van allergeenhomologen, isovormen en vouwvarianten (bijv. Hypoallergeniciteit) te onderzoeken, evenals de effecten van liganden op de allergene activiteit. Een meer recente toepassing omvat het gebruik van de test om de werkzaamheid van de behandeling in de loop van allergeenimmunotherapie te controleren.
Type I overgevoeligheidsreacties, gekenmerkt door immunoglobuline E (IgE) productie specifiek voor een respectievelijk antigeen, treffen bijna een derde van de wereldbevolking. Deze reacties worden geassocieerd met verschillende allergische manifestaties zoals astma en rhinoconjunctivitis en kunnen zelfs leiden tot systemische levensbedreigende reacties1. In tegenstelling tot in vivo tests zijn immunochemische benaderingen, zoals de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), uitsluitend geschikt voor het onderzoeken van de doelbinding van antilichamen, maar richten ze zich niet op het functionele aspect van eiwitten die onmiddellijke overgevoeligheidsreacties kunnen veroorzaken. De immobilisatie van de allergenen op vaste steunen (bijv. ELISA-platen) kan veranderingen in hun structurele integriteit en de vernietiging van allergierelevante epitopen veroorzaken2. Zelfs huidpriktests (SPT), het meest voorkomende hulpmiddel om sensibilisatie tegen bepaalde allergenen te bevestigen, hebben hun limieten met betrekking tot de detectie van symptomatische IgE-gemedieerde voedselallergie of allergene beschikbaarheid3,4. Om een ethische, zeer specifieke, gevoelige en kosteneffectieve methode te vinden voor het testen van de biologische potentie van allergenen om een type I overgevoeligheidsreactie te veroorzaken, zijn de zogenaamde mediator release assays vastgesteld.
Het principe van deze testen is gebaseerd op gebeurtenissen na de sensibilisatiefase en het bijbehorende vermogen van IgE om zich te binden aan de α-keten van de receptoren met hoge affiniteit die tot expressie komen op het oppervlak van effectorcellen, zoals mestcellen en basofielen. IgE wordt voornamelijk geproduceerd door plasmacellen in het mucosaal geassocieerde lymfoïde weefsel. Hoewel het de minst overvloedige immunoglobuline is (ongeveer 0,05% bij niet-atopische personen) in het bloed, bezit het een buitengewoon hoge biologische activiteit die de belangrijkste oorzaak is van allergische symptomen. De halfwaardetijd van IgE kan toenemen van 2-3 dagen tot enkele weken en zelfs maanden wanneer het gebonden is aan de receptoren op effectorcellen. Daaropvolgende binding van een antigeen aan het variabele gebied van twee receptorgebonden IgE-moleculen leidt tot hun verknoping gevolgd door de inductie van een stroomafwaartse signaalcascade in de effectorcel die leidt tot degranulatie en de afgifte van verschillende pro-inflammatoire mediatoren die vaatverwijding veroorzaken, zoals histamine, serineproteasen (bijv. Tryptase) en prostaglandinen5,6,7. De secretie van cytokines zoals interleukine 4 (IL-4) en IL-13 zijn verantwoordelijk voor het behoud van de inflammatoire T helper 2 (Th2) respons en de klasse-omschakeling van B-cellen naar IgE-producerende plasmacellen5,8,9. Aan de andere kant veroorzaakt vrijgegeven tromboxaan bronchoconstrictie en leukotriënen stimuleren gladde spiercontractie en vasculaire lekkage en spelen een cruciale rol bij luchtwegontsteking die leidt tot astma of allergische rhinitis10,11.
Onderzoeksinstrumenten voor het analyseren van de meeste van de bovengenoemde mediators zijn vastgesteld, hoewel met enkele grote nadelen. Tryptase-assays zijn geschikte klinische benaderingen voor het meten van systemische anafylaxie door mestcelactivering, maar hun gevoeligheid en specificiteit bij allergiediagnoses is te onnauwkeurig in vergelijking met gouden standaardmethoden zoals SPT. Aan de andere kant zijn cysteinyl leukotrieentests niet in staat om allergieën voor β-lactams of niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen te diagnosticeren12. Protocollen voor het meten van histamine als een belangrijke mediator die vrijkomt bij allergische reacties werden al in de jaren 1960 vastgesteld. Eenmaal vrijgegeven in het perifere bloed, wordt histamine onmiddellijk afgebroken door histaminemethyltransferasen, wat resulteert in een plasmahalfwaardetijd van slechts enkele minuten, waardoor de analyse ervan behoorlijk uitdagend is13. Afgezien van de instabiliteit, bleek de monitoring van histamine een lage specificiteit en gevoeligheid te hebben voor medicijnallergieën, evenals commerciële voedseleiwitten en wespengif12.
In vitro modellen met effectorcellijnen zijn geïntroduceerd als alternatief voor de arbeidsintensieve procedures van isolatie en cultivering van basofielen van allergische patiënten om afgiftetests uit te voeren. Daarom is de op basofiele leukemie (RBL) gebaseerde test bij ratten met behulp van de RBL-2H3-cellijn vastgesteld3. Omdat deze cellijn niet in staat is om menselijk IgE te binden, werd het eerst getransfecteerd met de α-, β- en γ-keten van de menselijke IgE-plasmamembraanreceptor (FcεRI). Verschillende klonen zijn gegenereerd en getest op expressieniveaus en homogeniteit van de menselijke α-chain, waarvan de kloon RBL-30/25 naar voren kwam als de meest veelbelovende kandidaat voor in vitro testen. De signaalcascade geïnduceerd bij receptoractivering van de getransfecteerde kloon werd getest via calciummobilisatietests. Als indicator voor degranulatie en surrogaat voor histamineafgifte werd het lysosomale enzym β-hexosaminidase gemeten, wat het aanzienlijke voordeel heeft van een hogere stabiliteit14. De mediatorafgifte met behulp van RBL-30/25-cellen bereikt tot 100% en wordt daarom gebruikt om sera afkomstig van allergische patiënten te testen. De test werd getest op de afgifte van de mediator na het uitdagen van gesensibiliseerde cellen met commerciële allergeenextracten. Dit leidde tot de bevinding dat er een enorme variatie is in de samenstelling (tot 60-voudig met betrekking tot het totale eiwitgehalte) van allergeenextracten afgeleid van verschillende fabrikanten en gebruikt voor diagnostische (bijv. SPT) of therapeutische benaderingen3,15,16.
Hierin geven we een gedetailleerde beschrijving van het RBL-protocol om de mediator release assay uit te voeren met behulp van serum van allergische donoren. Tijdens passieve sensibilisatie wordt IgE in het serum opgevangen door de hoge affiniteit FcεR1-receptor die tot expressie komt op het oppervlak van de basofiele cellen. Bij antigeenstimulatie zijn gebonden IgE’s die specifiek zijn voor het antigeen verknoopt, waardoor celdegranulatie en de afgifte van de mediator β-hexosaminidase worden geactiveerd. De activiteit van β-hexosaminidase wordt vervolgens gemeten met behulp van een geschikt substraat. Voor de test werden huRBL-2H3-cellen gebruikt en huRBL genoemd in het volgende protocol. Het protocol beschrijft een standaard antigeenverdunningsreeks met 8 stappen verdund 1:10 variërend van 1 μg / ml tot 0,1 pg / ml allergeen.
De hierin beschreven huRBL cel-gebaseerde mediator release assay is een robuuste methode die gemakkelijk kan worden uitgevoerd en geïmplementeerd in elk laboratorium. De enige vereiste is dat cellen onder steriele omstandigheden moeten worden gekweekt. De test wordt gebruikt om de waarschijnlijkheid van een allergeen of allergene bron te beoordelen om de IgE-crosslinking en basofiele degranulatie van patiënten op te roepen17. De test kan gemakkelijk worden aangepast aan elk allergeen of allergene bron, zolang het serum van de patiënt met een hoog niveau van specifiek IgE, waarbij het allergeen van belang wordt herkend, beschikbaar is. Het wordt aanbevolen om naast de mediator release assay een cel levensvatbaarheidstest uit te voeren om rekening te houden met mogelijke cytotoxische effecten die kunnen leiden tot slechte testprestaties. Dit kan te wijten zijn aan onvolledige complement-inactivatie van de sera of andere van serum afgeleide cytotoxische effecten. Zelfs het antigeen zelf, bijvoorbeeld vanwege proteolytische / enzymatische activiteit, kan de huRBL-cellen beschadigen. We gebruiken meestal een cel levensvatbaarheidstest met MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) om potentiële cytotoxische effecten te evalueren. De test kan eenvoudig worden uitgevoerd met de huRBL-cellen die overblijven nadat het celsupernatant is verzameld en overgedragen (zie stap 6.3. van het protocol). Vergeleken met andere immunochemische methoden, zoals ELISA’s en western blotting, voor het bepalen van het allergene potentieel van individuele allergenen of complexe extracten op basis van allergeen-IgE-binding, kan deze test niet alleen de binding van IgE aan een allergeen detecteren, maar kan ook de functionaliteit van zowel menselijk IgE als het allergeen meten, om IgE-gemedieerde basofieldegranulatie uit te lokken18. Het kan dus helpen bij het bestuderen van de ernst van allergische symptomen ex vivo met behulp van sera van patiënten. De test is naar verluidt consistenter en efficiënter dan de klassieke passieve cutane anafylaxietests, omdat de test gebruik maakt van de RBL-2H3-cellen, die relatief gemakkelijk te hanteren zijn en minder variabiliteit in resultaten produceren in vergelijking met primaire cellen, zoals mestcellen of menselijke basofielen19,20. Daarnaast geeft de test een goede weergave van de biologische activiteit van allergenen en kan het totale allergeengehalte in een bepaald complex monster nauwkeurig worden geschat3. Voor het oplossen van problemen met bepaalde stappen in het protocol raadpleegt u tabel 1.
Wat betreft de toepasbaarheid van deze versie van de mediator release assay, het is meestal gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, maar ook voor de standaardisatie van allergene extracten op basis van hun biologische activiteit. Dit omvat de analyse van verschillende batches SPT-oplossingen, provocatietestoplossing, evenals extracten die worden gebruikt voor allergeenspecifieke immunotherapie; zoals getoond voor pollen, huidschilfers van katten, huisstofmijt en pinda-extracten, evenals bijengif3,17,21. De techniek kan vooral worden toegepast bij het diagnosticeren van voedselallergieën, omdat het zelfs minimale hoeveelheden allergene bestanddelen in complexe voedingsmiddelen zoals pinda’s, melk, tarwe en eieren kan detecteren22. In dit verband is het ook gerapporteerd als een waardevol hulpmiddel voor de beoordeling van de allergeniciteit van dierlijke voedselallergenen, zoals tropomyosinen, en kan het helpen bij het onderscheiden van krachtige allergenen van niet-allergenen23. Als onderzoeksinstrument wordt de test gebruikt om de impact van voedselverwerking te bestuderen en om de invloed van ligandbinding op allergenen en het effect ervan op allergeniciteit te evalueren24,25. Het was bijvoorbeeld aangetoond dat de binding van Bet v 1 aan liganden de allergeen-IgE-crosslinking niet beïnvloedde, hoewel het een toename van de thermische en proteolytische stabiliteit veroorzaakte25. De test kan worden gebruikt om de reactiviteit van de patiënt op kleine en belangrijke allergenen te vergelijken, evenals om de kruisreactiviteit van allergenenhomologen en isovormen te onderzoeken, zoals te zien is in ons voorbeeld met Bet v 1 en het homologe voedselallergeen Cor a 1 (figuur 3). Met betrekking tot allergene isovormen werd de mediator release assay gebruikt om het belangrijkste allergeen Amb a 1.01 te identificeren als de meest krachtige IgE-reactieve isovorm in ambrosiapollen (Ambrosia artemisiifolia). Ter vergelijking: de andere twee geïdentificeerde isovormen in ambrosiapollenextracten, Amb a 1.02 en Amb a 1.03, vertoonden een verminderde reactiviteit op het IgE26 vanpatiënten.
In de afgelopen jaren is de test toegepast om potentiële anti-allergische verbindingen en nieuwe hypoallergene varianten van allergenen te bestuderen, wat helpt bij de identificatie van geschikte kandidaten voor allergeenspecifieke immunotherapie27,28. Een andere nieuwe benadering is om de test te gebruiken om de werkzaamheid van de behandeling te controleren in de loop van allergeenspecifieke immunotherapie. In dit verband ontwikkelde onze onderzoeksgroep een huRBL-testremmingssysteem, dat goed correleerde met de vermindering van de symptoomscore van de patiënt tijdens allergeenspecifieke immunotherapie29. De test is ook voorgesteld om de immunosuppressieve effecten van TGFβ1 op allergeen-geïnduceerde IgE-gemedieerde degranulatiete bestuderen 30.
De beperkingen van de test zijn dat hoewel de huRBL-cellen enkele kenmerken van mestcellen of basofielen bezitten, ze de natuurlijke functie van deze effectorcellen niet volledig nabootsen. Mestcellen drukken bijvoorbeeld op grote schaal de patroonherkenningsreceptor Toll-like receptor 4 (TLR4) uit, die nodig is voor pathogeenherkenning, terwijl deze volledig tekortschiet in de RBL-2H3-cellen31. Vanwege dit verschil in functionaliteit bootst de test de echte situatie niet volledig na, wat in gedachten moet worden gehouden bij het interpreteren van de gegevens. Aangezien de huRBL-cellen kankerachtige basofiele cellen zijn, kunnen veranderingen in kweekomstandigheden en langdurige kweek bovendien leiden tot fenotypische verschillen die leiden tot veranderde resultaten tussen verschillende laboratoria20. Een ander aspect is de keuze van de allergeenconcentratie waarmee rekening moet worden gehouden bij het aanpassen van deze methode, aangezien hoge allergeenconcentraties kunnen leiden tot niet-IgE-gemedieerde degranulatie als gevolg van de aanwezigheid van grote hoeveelheden proteasen of endotoxinen18. Andere beperkingen zijn de afhankelijkheid van menselijke sera met relatief hoge specifieke IgE-niveaus (RAST-klasse 5-6) en de behoefte aan celkweeksystemen, wat een obstakel blijft dat moet worden overwonnen om de techniek in de dagelijkse klinische routine te implementeren.
Afgezien van deze beperkingen, vertegenwoordigt de huRBL-test een waardevol onderzoeksinstrument voor de diagnose en behandeling van allergische aandoeningen en kan deze in een breed scala aan toepassingen worden gebruikt.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen prof. Dr. Stefan Vieths van de afdeling Moleculaire Allergologie, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Duitsland, bedanken voor het leveren van de ges vermenselijkte / FcεRI-getransfecteerde RBL-cellen en voor het geven van zijn toestemming om dit onderzoeksmethodologiepaper te schrijven. We willen Prof. Dr. Fatima Ferreira bedanken voor het geven van uitstekende feedback. Verder willen we Prof. Dr. Ronald van Ree en Dr. Jaap Akkerdaas van de afdeling Experimentele Immunologie, Amsterdam Universitair Medische Centra, locatie AMC, Amsterdam, Nederland, bedanken voor hun toestemming voor het publiceren van representatieve gegevens in dit methodenpaper, die zijn gegenereerd in de loop van het project BM4SIT – innovaties voor allergie (www.BM4SIT.eu). Het werk van de auteurs is ondersteund door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (Project P32189), door het prioriteitsprogramma Allergie-Kanker-BioNano Research Centre van de Universiteit van Salzburg, door het doctoraatsprogramma Immuniteit in Kanker en Allergie-ICA gefinancierd door het Oostenrijkse Wetenschapsfonds (FWF W01213) en door het BM4SIT-project (subsidienummer 601763) uit het zevende kaderprogramma van de Europese Unie FP7.
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
Citric acid | Applichem | 131018 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
G418 | Sigma | A1720 | |
Glycine | Applichem | A3707 | |
Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |