여기서 우리는 인간 IgE 수용체에 감염된 쥐 배혈세포세포를 사용하여, 제1형 알레르기 반응에서 전형적으로 관찰되는 이펙터 세포의 분해를 시뮬레이션하기 위해 중재자 방출 분석체를 제시한다. 이 방법은 매우 민감하고 재현 가능하며 맞춤성 방식으로 알레르겐의 생물학적 활성을 조사합니다.
중재자 방출 분석은 체외 면역글로불린 E(IgE)-매개 된 탈과및 마스트 세포 및 바소필과 같은 이펙터 세포에 의한 중재자의 분비분석, 푸티알레겐의 연쇄 희석으로 자극시. 따라서, 이러한 소심은 감각화된 환자 또는 피부 찌르기 시험에서 알레르겐 노출에 따라 발생하는 생체 내 탈과화 과정을 모방하는 필수적인 도구를 나타냅니다. 추가적으로, 이 사실약은 일반적으로 단백질의 알레르기성 잠재력 및 환자의 sera의 반응성을 조사하기 위하여 이용됩니다. 본명, 우리는 인간 고친화 IgE 플라즈마 막 수용체(FcθRI)와 함께 감염되고 인간화된 불멸의 쥐 바소필 백혈병 세포주체를 사용하여 간단한 2일 프로토콜을 설명한다. 이러한 중재자 방출 분석의 이 변종은 항원들을 고체 행렬에 고정시킬 필요 없이 체외 세포 기반 시스템에서 견고하고 민감하며 재현가능한 시스템이다. 프로토콜은 다음과 같은 단계로 구성됩니다: (1) 인간 세라의 비활성화를 보완하고, (2) 세포의 수확, 파종 및 수동 감광, (3) 항원과의 자극은 항원 방출을 유발하고, (4) β-헥소사미니다제 활성을 측정하여 방출된 염증 성 중재자에 대한 대리로서, 그의 tamine과 같은 방출된 염증 성 중재자에 대한 대리로서 측정한다. 상기 분석은 알레르겐-IgE 교차 연결의 용량을 평가하여 세포 탈과화를 유발하는 유용한 도구를 나타내며, 알레르겐 추출물을 표준화하기 위해 구현될 수 있고, 환자의 반응성 반응을 경미한 또는 주요 알레르겐 추출물(꽃가루, 고양이 단상 등)과 비교하여 알레르겐 균질, 동소형태 및 접이식(예: 저자극성)의 효능과 모든 알레르기 유발 활동에 대한 리간드의 효과를 조사합니다. 최근에 적용된 적용은 알레르겐 면역요법 과정에서 치료 효능을 모니터링하기 위한 분석의 사용을 포함한다.
타입 I 과민반응, 면역글로불린 E (IgE) 각 항원에 특정한 생산을 특징으로 하는, 세계 인구의 거의 3분의 1에 영향을 미칩니다. 이러한 반응은 천식과 코뿔소 결막염과 같은 여러 알레르기 증상과 관련이 있으며 전신 생명을 위협하는 반응1로이어질 수도 있습니다. 생체 내 시험과 달리, 효소-연결된 면역소벤터벤트 분석(ELISA)과 같은 면역화학적 접근법은 항체의 표적 결합을 조사하기에만 전적으로 적합하지만 즉각적인 과민반응반응을 유발할 수 있는 단백질의 기능적 측면을 다루지는 않는다. 고체 지지대(예를 들어, ELISA 플레이트)에 대한 알레르겐의 고정은 구조적 무결성및 알레르기 관련 에피토프2의파괴에 변화를 일으킬 수 있다. 특정 알레르겐에 대한 민감성을 확인하는 가장 일반적인 도구인 피부 찌르기 검사(SPT)조차도 증상 IgE 매개 식품 알레르기 또는 알레르겐 가용성3,4의검출에 관한 한계가 있다. 알레르겐의 생물학적 효능을 시험하여 I형 과민반응을 유발하는 윤리적이고, 매우 구체적이고, 민감하며, 비용 효율적인 방법을 찾기 위해, 소위 중재자 방출 소법이 확립되었다.
이러한 아세의 원리는 유방 세포 및 바소필과 같은 이펙터 세포의 표면에 발현된 친화성 수용체의 α 사슬에 결합하는 민감화 단계및 IgE의 동반 능력에 따른 이벤트에 의존한다. IgE는 주로 점막 관련 림프조직에서 혈장 세포에 의해 생성된다. 혈액에서 면역글로불린(비아토피 개인의 약 0.05%)이 가장 적게 풍부하지만 알레르기 증상의 주요 원인이 되는 매우 높은 생물학적 활성을 가지고 있습니다. IgE의 반감기에서 증가 할 수 있습니다 2-3 일 몇 주 및 심지어 개월 이펙터 세포에 그것의 수용 체에 바인딩 될 때. 두 수용체 바인딩 된 IgE 분자의 가변 영역에 항원을 후속 결합은 히스타민, 세린 프로테게이제 (예를 들어, 5) 및 시험대와 같은 혈관 확장을 일으키는 여러 프로 염증 중재자의 탈과화 및 방출로 이어지는 이펙터 세포에서 하류 신호 캐스케이드의 유도에 이어 그들의 교차 연결로이어집니다. 인터류킨 4(IL-4) 및 IL-13과 같은 사이토카인의 분비성은 염증성 T 도우미 2(Th2) 반응및 B 세포의 클래스 스위칭을 이그에 생성 플라즈마세포5,8,9로의 한부 로 전환시키는 데 책임이 있다. 한편, 방출된 혈소판은 기관지 수축을 유발하고, 백호리엔스는 혈관 누설뿐만 아니라 원활한 근육 수축을 자극하고, 천식 또는 알레르기성비염(10,11)으로이어지는 기도 염증에 중요한 역할을 한다.
앞서 언급한 대부분의 중재자를 분석하기 위한 연구 도구가 설립되었지만 몇 가지 주요 단점이 있습니다. 트립타제 분석법은 마스트 세포 활성화를 통해 전신 아나필락시스의 측정을 위한 적절한 임상 접근법이지만, 알레르기 진단의 민감도 와 특이성은 SPT와 같은 금 표준 방법에 비해 너무 부정확하다. 한편, 시스테닐 백혈구트리엔 어약은 β-락탐 또는 비스테로이드성항염증제(12)에대한 알레르기를 진단할 수 없다. 알레르기 반응에서 방출된 주요 중재자로서 히스타민의 측정을 위한 프로토콜은 이미 1960년대에 확립되었습니다. 일단 말초 혈액에서 풀어 놓이면, 히스타민은 히스타민 메틸 전달체에 의해 즉시 저하되어 단 몇 분의 플라즈마 반감기가 발생하여 분석이 매우 도전적입니다13. 그 불안정을 제외하고, 히스타민의 모니터링은 약물 알레르기뿐만 아니라 상업용 식품 단백질 및 말반독(12)에대한 낮은 특이성과 민감성을 갖는 것으로 나타났다.
이펙터 세포주를 가진 체외 모형은 방출 적인 소의를 능력을 발휘하기 위하여 알레르기성 환자에게서 basophils의 격리 그리고 재배의 노동 집약적인 절차에 대한 대안으로 소개되었습니다. 따라서, RBL-2H3 세포주 사용하래의 쥐 배혈백혈병-(RBL-) 기반 분석이3확립되었다. 이 세포주인간 IgE를 결합할 수 없기 때문에, 인간 IgE 플라즈마 막 수용체(FcθRI)의 α, β 및 γ 사슬에 처음으로 감염되었다. 몇몇 클론은 인간 α 사슬의 발현 수준 및 균질성에 대해 생성되고 시험되었으며, 그 중 클론 RBL-30/25는 체외 검사를 위한 가장 유망한 후보로 나타났습니다. 트랜스 감염 된 클론의 수용 체 활성화에 유도 하는 신호 폭포 칼슘 동원 분석을 통해 테스트 했다. 히스타민 방출을 위한 탈과화 및 대리를 나타내는 지표로서, 리소소말 효소 β-헥소사미니다제는 더 높은안정성(14)의유의한 장점을 갖는다. RBL-30/25 세포를 사용하여 중재자 방출은 최대 100%에 도달하고, 따라서, 알레르기 환자에서 파생된 세라를 시험하기 위하여 이용됩니다. 분석은 상업적인 알레르겐 추출물로 감세 세포에 도전한 후에 중재자 방출을 위해 시험되었습니다. 이는 상이한 제조자로부터 유래되고 진단(예를 들어, SPT) 또는 치료접근법3,15,16에사용되는 알레르겐 추출물의 조성물(총 단백질 함량에 관하여 최대 60배)의 엄청난 변이가 있다는 것을 발견하게 되었다.
본 원에서, 우리는 알레르기 기증자로부터 혈청을 사용하여 중재자 방출 분석기를 수행하기 위해 RBL 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 수동 감질 동안, 혈청에서 IgE는 호포필 세포의 표면에 발현된 높은 친화성 FcθR1 수용체에 의해 포획된다. 항원 자극시, 항원특이적 EEs는 교차 연결되어 세포 탈과화및 β-헥소사미니다제의 방출을 유발한다. β-헥소사미니다제의 활성은 이후에 적합한 기판을 사용하여 측정된다. 분석의 경우, huRBL-2H3 세포가 사용되었고, 다음 프로토콜에서 huRBL이라고 불었다. 이 프로토콜은 1 μg/mL에서 0.1 pg/mL에 이르는 8단계의 희석된 표준 항원 희석 계열을 설명합니다.
본 명세서에서 설명된 huRBL 세포 계측기 방출 분석법은 임의의 실험실에서 쉽게 수행하고 구현할 수 있는 견고한 방법입니다. 유일한 요구 사항은 세포가 멸균 조건하에서 재배될 필요가 있다는 것입니다. 분석은 환자의 IgE 교차 연결 및 바소필 탈립17을연상시키기 위하여 알레르기 항원 또는 알레르기 성 근원의 가능성을 평가하기 위하여 이용됩니다. 분석은 관심있는 알레르겐을 인식하는 특정 IgE의 높은 수준의 환자의 혈청이 가능한 한 알레르기 항원 또는 알레르기 성 소스에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 분석 성능저하를 초래할 수 있는 잠재적인 세포독성 효과를 설명하기 위해 중재자 방출 분석 외에도 세포 생존 가능성 분석작업을 수행하는 것이 좋습니다. 이것은 세라 또는 다른 혈청 유래 세포 독성 효과의 불완전한 보완 불활성화 때문일 지도 모릅니다. 항원 자체조차도 예를 들어, 프로테오리틱/효소 활성으로 인해 huRBL 세포에 해를 끼칠 수 있다. 우리는 일반적으로 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로미데를 사용하여 잠재적인 세포 독성 효과를 평가하고 있습니다. 분석체는 세포 상체가 수집되고 옮겨진 후에 남은 huRBL 세포로 쉽게 수행될 수 있다(프로토콜의 단계 6.3. 참조). ELISA 및 서부 블로팅과 같은 다른 면역 화학 적 방법과 비교하여, 알레르겐-IgE 결합에 기초한 개별 알레르겐 또는 복잡한 추출물의 알레르기 성 잠재력을 결정하기위한, 이 분석법은 알러지 유발 물질에 IgE의 결합뿐만 아니라 검출 할 수 있지만, 인간IgE와 알레르겐 의 기능을 측정 할 수 있습니다, 이그E -media.. 따라서, 환자의 세라를 이용한 알레르기 증상 전 생체 의 중증도를 연구하는 데 도움이 될 수 있다. 분석체는 분석이 RBL-2H3 세포를 활용하기 때문에 고전적인 수동 분리 성 아나필락시스 테스트보다 더 일관되고 효율적이라고 보고되며, 이는 상대적으로 취급하기 쉽고, 돛대 세포 또는 인간 적인 basophils19,20과같은 1 차세포에 비해 결과에 더 적은 가변성을 생성한다. 이 외에도, 분석법은 알레르겐의 생물학적 활성을 양호하게 나타내며 주어진 복잡한 샘플3에서총 알레르겐 함량을 정확하게 추정할 수 있다. 프로토콜의 특정 단계를 해결하려면 표 1을참조하십시오.
이 버전의 중재자 방출 분석법의 적용가능성에 관해서는, 주로 연구 목적뿐만 아니라 생물학적 활성에 기초한 알레르기 추출물의 표준화를 위해 사용되었습니다. 여기에는 SPT 솔루션의 상이한 배치, 도발 테스트 솔루션뿐만 아니라 알레르겐 특이적 면역 요법에 사용되는 추출물의 분석이 포함됩니다. 꽃가루, 고양이 dander, 집 먼지 진드기 및 땅콩 추출물뿐만 아니라 꿀벌 독3,17,21에도시된 바와 같이. 이 기술은 땅콩, 우유, 밀 및계란(22)과같은 복잡한 식품에서 최소한의 알레르기 성분을 감지할 수 있기 때문에 특히 식품 알레르기 진단에 적용될 수 있다. 이러한 점에서, 또한 tropomyosins와 같은 동물성 식품 알레르겐의 알레르기성 평가를 위한 귀중한 도구로 보고되고,비알레르겐(23)으로부터강력한 알레르겐을 구별하는 데 도움이 될 수 있다. 연구 도구로서, 분석법은 알러지 유발 물질에 대한 리간 결합의 영향과알레르기성(24,25)에미치는 영향을 평가하기 위해 식품 가공의 영향을 연구하는 데 사용된다. 예를 들어, Bet v 1에서 리간드에 대한 바인딩은 열 및 프로테올리컬안정성(25)의증가를 유발했음에도 불구하고 알레르겐-IgE 교차 연결에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 분석은 환자의 반응성을 경미한 및 주요 알레르겐과 비교하고, 배브 v 1 및 동형 식품 알러지 유발 물질 코르 a1(도 3)을사용하여 당사의 예에서 와 같이 알레르겐 균질 및 동소형태의 상호 반응성을 조사하는 데 사용될 수 있다. 알레르겐 이소폼에 대해, 중재자 방출 분석체는 래그위드꽃가루(Ambrosia artemisiifolia)에서가장 강력한 IgE 반응성 이소폼으로서 주요 알러지 유발 물질 암1을 식별하는 데 사용되었다. 비교하여, 다른 두 개의 확인된 등화꽃 추출물, Amb a 1.02 및 Amb a 1.03, 환자의 IgE26에대한 반응성이 감소된 것으로 나타났다.
최근 몇 년 동안, 알레르겐의 잠재적인 항알레르기 화합물및 새로운 저자극성 변이체를 연구하기 위해 분석이 적용되어 알레르겐 특이적 면역요법에 적합한 후보자의식별을돕는27,28. 또 다른 새로운 접근법은 알레르겐 특이적 면역 요법 과정에서 치료 효능을 모니터링하기 위해 분석법을 사용하는 것입니다. 이와 관련하여, 우리의 연구그룹은 huRBL 분석 억제 시스템을 개발하여 알레르겐 특이적면역요법(29)에서환자의 증상 점수 감소와 잘 상관관계가 있다. 분석은 또한 알레르겐 유도 된 IgE 매개탈란화 30에TGFβ1의 면역 억제 효과를 연구하기 위해 제안되었다.
분석의 한계는 huRBL 세포가 비만 세포 또는 basophils의 몇몇 특징을 가지고 있더라도, 그(것)들이 완전히 이펙터 세포의 자연적인 기능을 모방하지 않는다는 것입니다. 예를 들어, 마스트 세포는 RBL-2H3세포(31)에서완전히 결핍된 반면, 병원균 인식에 필요한 패턴 인식 수용체 톨-라이크 수용체 4(TLR4)를 널리 발현한다. 기능의 차이로 인해 분석은 데이터를 해석할 때 염두에 두어야 하는 실제 상황을 완전히 모방하지 않습니다. 또한, huRBL 세포는 암성 혈관세포이기 때문에, 배양 조건의 변화와 장기간 배양은 상이한 실험실 들 사이에서 변경된 결과로 이끌어 내는 현상형 차이로 이끌어 낼 수있다(20). 또 다른 양태는 높은 알레르겐 농도가 높은 프로테아제 또는내독신(18)의존재로 인해 비-IgE 매개 탈과화를 초래할 수 있기 때문에 이 방법을 적응할 때 고려해야 할 알레르겐 농도의 선택이다. 그밖 한계는 상대적으로 높은 특정 IgE 수준 (RAST 급 5-6)를 가진 인간 세라에 대한 의존성 및 매일 임상 루틴에서 기술을 구현하기 위하여 극복될 필요가 있는 장애물남아 있는 세포 배양 시스템에 대한 필요성입니다.
이러한 제한 외에도 huRBL 분석은 알레르기 질환의 진단 및 치료를 위한 귀중한 연구 도구를 나타내며 광범위한 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 분자 알레르기학부의 스테판 비에스 교수, 폴-에를리히-인스티투트, 랑겐, 독일, 인간화/FcθRI-전염된 RBL 세포를 제공하고 이 연구 방법론 논문을 작성하는 데 동의한 것에 대해 감사드립니다. 우리는 훌륭한 피드백을 제공 파티마 페레이라 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 실험 면역학의 학과의 박사 로널드 반 리와 박사 Jaap Akkerdaas, 암스테르담 대학 의료 센터, 위치 AMC, 암스테르담, 네덜란드, 프로젝트 BM4SIT의 과정에서 생성 된이 방법 논문에 제공 된 대표 데이터를 게시하는 데 동의를 부여에 감사드립니다 – 알레르기에 대한 혁신 (www.BM4SIT.eu). 저자의 작품은 오스트리아 과학 기금 (프로젝트 P32189), 잘츠부르크 우선 프로그램 알레르기 – 암 – 바이오 나노 연구 센터, 오스트리아 과학 기금 (FWF W01213)에 의해 투자 암과 알레르기 – ICA박사 프로그램 면역에 의해, 그리고 유럽 연합 (EU)의 제 7 프레임 워크에서 BM4SIT 프로젝트 (보조금 번호 601763)에 의해 지원되었습니다.
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
Citric acid | Applichem | 131018 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
G418 | Sigma | A1720 | |
Glycine | Applichem | A3707 | |
Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |