ヒト化メディケーターは、アレルゲン効力の読み取りとしてアッセイをリリース

このメディター放出アッセイは、huRBL細胞(図1A およびB)に基づいて、ベル状の線量応答曲線をもたらす(図1C)。データ表現を簡略化するために、半最大メディター放出に必要な抗原濃度は、線形回帰を用いて計算することができる(図1D)。細胞生存アッセイは、感作血清または刺激に使用される抗原のいずれかから得られる細胞傷害効果を排除するために行われる(図1E)。アッセイは、ある抗原に対する異なるセラの反応性を試験するために使用することができる。我々の場合、白樺花粉アレルギー患者に由来する5つのセラのうち4人がBet v 1刺激に反応した。血清#1は最高のメディターリリースを示した(図2)。血清#5はBet v 1刺激に反応せず、したがって、他の白樺花粉アレルゲン(例えば、ベットv 2、プロフィリン)に反応する可能性があります。これらのデータは、Bet v 1がIgE媒介性アレルギー症状の原因となる強力なアレルゲンであることを示しています。huRBLアッセイを用いることで、相同性アレルゲンに対するIgEの交差反応性を評価することができる(図3)。ここでは、両方の白樺花粉アレルギー患者がBet v 1によく反応したのに対し、患者#2だけがヘーゼルナッツに見られるBet v 1-相同の食物アレルゲンであるCor a 1にも応答した。これらのデータに基づいて、患者#2は、患者#1よりも高い1-クロス反応性IgEレベルの高いCorを有する可能性が最も高く、ヘーゼルナッツ消費時に経口アレルギー症状をもたらす。アレルゲンの変異変異型変異体の低刺激性の評価(効力の低下)も分析し、その野生型と比較することができる(図4)。提供された例では、フォールド変異体の放出曲線は、野生型アレルゲンに比べてより高い抗原濃度に向かってシフトし、その結果、半分の最大放出を引き起こすのに必要な抗原の濃度が有意に高くなる(図4B)。これらのデータは、生成された変異型/折り畳み変異体が野生型タンパク質と比較してアレルギー性が低いことを示唆している。IgE媒介脱顆粒を引き起こすこの還元された効力は、フォールド変異体の低刺激性特性を強調する。このアッセイに基づいて、フォールド変異体は治療中にIgE関連の副作用を減少させる可能性があるため、アレルゲン特異的免疫療法の興味深い候補である。 図1:ヒト化RBL細胞とIgE-アレルゲン架橋誘導β-ヘキソサミニダーゼ放出の代表的なベル状曲線 RBL細胞は培養フラスコに付着しており、自分自身を取り付けようとしている棒状の形を与える(A)。収穫される細胞のための合流の理想的なレベルは90%以下である(B)。細胞はそれぞれ40倍と10倍の倍率で示される。組換えベットv 1(rBet v 1)との挑戦に反応する白樺花粉アレルギー個体のヒト血清で感作した細胞は、主要なバーチ花粉アレルゲン(C)である。メディエーター放出の代理として、βヘキソサミニダーゼ活性は細胞上清で測定される。このベル状の曲線は、アレルゲンの過剰によるIgE上の抗原エピトープの一価の職業から生じ、高い抗原濃度でのアレルゲン-IgE架橋を競合的に阻害する。高アレルゲン濃度での低放出に関するもう一つの説明は、過剰な抗原の存在下での細胞内経路の阻害である。半最大放出を得るために必要なアレルゲン濃度の決定のために、メディター放出曲線の傾きの線形部分を表す実験値に基づく対数回帰線(D)を用いた。赤い点線は、計算に使用される対数回帰直線を表します。回帰直線の数式は赤で表示されます。半分の最大リリースは、半分の最大リリース = (最小リリース値 + 最大リリース値)/2 と定義されます。この例では、計算された半分の最大放出は20.6%でした。この実験で使用した代表的なヒト血清はhuRBL細胞とのインキュベーション用に1:20希釈し、刺激に使用される抗原濃度はベットv1の100μg/mLから0.004 pg/mLに及んだ。細胞生存アッセイ(この場合MTTアッセイ)を、抗原刺激後の残りの細胞と共に行い、細胞生存率および細胞数に対する抗原希釈の影響を評価する(E)。未処理の背景細胞およびリシス細胞(最大リシス)は、点線で示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:5つの異なるヒトセラのβ-ヘキソサミニダーゼ%放出の代表的な曲線 rBet v1の同じ抗原濃度範囲を、異なる白樺花粉感作者のセラで感作したhuRBL細胞と共にインキュベートした。症状の重症度に対応する異なる患者間の放出率の明確な差がある。患者#5は主要な白樺花粉アレルゲンベットv 1に非反応性であることに注意してください。これらのメディター放出曲線を得るために使用される5種の全てのヒトセラは、huRBL細胞とのインキュベーションのために等しく1:20に希釈した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:バーチ花粉のセラに由来するIgEの交差反応性は、Bet v 1相同種ヘーゼルナッツアレルゲンCora1を有する患者を感作した患者である。 白樺花粉に感作された患者の2つの代表的なセラは、Bet v 1に強く反応するとともに、相同性アレルゲンCora1に対してより少ない程度に反応する。患者2は、コルA1に対して有意な反応を示し、したがって、メディター放出がほとんど無視できる患者1と比較して、ヘーゼルナッツ消費時に経口アレルギー症状を示す可能性が高い。点線は、ヒトセラで感作されたがアレルゲンで刺激されない細胞であるノー抗原コントロールを表し、したがって、底部のシグナル高原/背景の指標となる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:rBet v 1野生型と低刺激性フォールドバリアントとの放出率の比較 白樺花粉感作者の同じ血清を、rBet v 1野生型(wt)と主要なバーチ花粉アレルゲンの低刺激性フォールド変種(A)でインキュベートした。メディター放出は両方の抗原に見られますが、同じパーセント放出に対してフォールドバリアントを野生型rBet v 1と比較すると、より高い抗原濃度に向かって明確なシフトがあります。異なる抗原の放出パーセントの差を比較する標準的な方法は、半分の最大放出を達成するために必要な抗原の濃度を計算することである(B)。これは通常、生物学的複製(異なるヒトセラにおけるアレルゲンごとに同じ抗原範囲の試験)で行われる。通常、重要な結論を導くために、メディエーター放出は、少なくとも8〜10の異なる患者からセラで行われる。ここでは、4つの異なるセラの結果を例にプロットします。ペアの t -testを使用して統計分析を行いました。*p ≤ 0.05;**p ≤ 0.01;p ≤ 0.001;p ≤ 0.0001. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 潜在的な質問とトラブルシューティング 解決 細胞応答性の変化によるアッセイ間の変動 細胞通過周期数が20~30の通過を超えないようにしてください。将来の実験のために早い段階で冷凍在庫を作る。 むしろ技術的なものよりも生物学的複製(異なるセラの使用)に依存しています。 セラは、特定のIgEの低レベルが含まれています 下段の最終血清希釈法は、1:20ではなく(すなわち1:10)使用することができる。逆に、特異的IgEの高レベルを含むセラをさらに希釈することができる(1:30または1:40)。 アッセイを実行するのに十分な細胞がない T-75フラスコの合流率が50~90%程度であることを確認してください。より多くのフラスコを通過します。 セラの細胞傷害効果、すなわち不完全な補体不活性化によるもの メディケータ放出アッセイに加えて、細胞生存アッセイを実行する。不完全な補体不活性化を避けるためにAg8濃度を増加させます。 低信号 dH2Oの代わりに1xタイローデのバッファーを重水素酸化物(D2O)に希釈するか、または関心のあるアレルゲンに特異的IgEのレベルが高いセラを使用することにより、アッセイのシグナル対雑音比を改善します。 アレルゲンはタイローデの緩衝液(例えば沈殿)で安定していない アッセイ処理の前に、1x Tyrodeの緩衝液で安定性試験を行ってください。タイローデのバッファの置換は推奨されません。 それぞれのアレルゲンの適切な開始濃度を見つける問題 完全なリリース曲線をカバーする希釈シリーズの適応(より多くの希釈ステップ、1:10の代わりに1:20希釈)。 低/ノーシグナルで示されるアッセイ性能の低下 セラまたは抗原刺激(酵素アレルゲンなど)による細胞傷害作用を避けてください。細胞を洗い、慎重に浸します。空気への暴露を長く避け、細胞が乾燥するのを防ぎます。 下の信号台に到達したかどうかを知る方法は? お皿に「抗原なし」コントロールを追加します。これらは感作細胞であり、1x Tyrodeの緩衝剤のみで刺激されたが、アレルゲンは含まない。 最大のリシスウェルに加えて、ポジティブコントロールが必要ですか? さらなる陽性対照として、脱顆粒を引き起こす血清と抗原の組み合わせを、または抗FcεR1抗体を使用することができる。 井戸はいくつ必要ですか? それはあなたの滴定シリーズ、あなたが分析したい抗原とセラの数に依存します。 テストするセラ/抗原の数に応じて、96 ウェルプレートのレイアウトを計画します。「無抗原コントロール」、バックグラウンド細胞(非感作、非刺激)、ならびに最大のリシスウェルを加えることを忘れないでください。 私は何セラをテストする必要がありますか?そして、私は複製が必要ですか? アッセイは非常に堅牢ですが、細胞の応答性が変化するためアッセイ間の変動があります。したがって、技術的な複製よりも生物学的複製(異なるseraを使用)に頼ることを推奨します。アレルゲンを分析するには、最低8種類のセラで十分です。しかし、図4Bに示すように、有意な結果は、より少ないセラを用いて既に得ることができる。 表 1: トラブルシューティング