人性化调解员发布分析作为过敏原效力的读出

调解人释放分析，基于huRBL细胞（图1A 和B），导致钟形剂量反应曲线（图1C）。对于简化的数据表示，可以使用线性回归（图 1D）计算半最大介导器释放所需的抗原浓度。进行细胞生存性检测，以排除从敏感血清或用于刺激的抗原中产生的细胞毒性效应（图1E）。检测可用于测试不同塞拉对某种抗原的反应。在我们的例子中，5个塞拉中，有4个来自白木花粉过敏患者，对Bet v 1刺激做出了反应。血清 #1 显示最高的调解人释放 （图 2）。血清 #5 没有响应 Bet v 1 刺激， 因此， 可能会对其他白木花粉过敏原 （例如， 投注 v 2， 普罗菲林） 做出反应。这些数据表明，Bet v 1 是一种有效的过敏原，负责 IgE 介质过敏症状。通过使用 huRBL 检测，可以评估 IgE 对同源过敏原的交叉反应（图 3）。在这里，两个白木花粉过敏患者对Bet v 1反应良好，而只有患者#2也回应了Cor a 1，Bet v 1同源食物过敏原发现粽子。根据这些数据，患者 #2 很可能具有比患者 #1 高 1 交叉反应 IgE 水平的 Cor，导致粽子消耗时的口腔过敏症状。甚至对过敏原突变变异（效力降低）的低过敏性性质的评估，也可以分析并与其野生型对应物进行比较（图4）。在所提供的示例中，折叠变异的释放曲线与野生型过敏原相比转向更高的抗原浓度，导致引起半最大释放所需的抗原浓度显著提高（图 4B）。这些数据意味着生成的突变/折叠变异与野生型蛋白质相比过敏性较低。这种降低的效力触发IgE介导的去粒突出折叠变种的低过敏性。基于此检测，折叠变种是过敏原特异性免疫治疗的有趣候选，因为它可能会在治疗过程中导致减少 IgE 相关副作用。 图1：人性化的RBL细胞和IgE-过敏原交叉连接诱导β-六氧沙米尼酶释放的具有代表性的钟形曲线。RBL细胞是粘附在培养瓶，这给了他们一个棒状的形状，因为他们试图连接自己（A）。细胞收获的理想汇合水平不超过90%（B）。细胞的放大倍数分别为40倍和10倍。与白木花粉过敏个体的人类血清敏感的细胞在挑战时与重组剂 Bet v 1 （rBet v 1） 发生反应， 主要的白木花粉过敏原（C）。作为调解人释放的代理，β-六氧沙米尼酶活性在细胞超分子中测量。钟形曲线是由于过敏原的过量而对IgE上的抗原表位进行单价占用的结果，这在竞争中抑制了高抗原浓度下的过敏原-IgE交叉连接。高过敏原浓度低释放的另一个解释是，在存在过量抗原的情况下抑制细胞内通路。为了确定获得半最大释放所需的过敏原浓度，使用了基于代表介质释放曲线斜度线性部分的实验值的对数回归线（D）。红色虚线表示用于计算的对数回归线。回归线的公式以红色显示。半最大释放定义为：半最大释放 = （最低释放值 = 最大释放值）/2。在示例中，计算的半最大释放值为 20.6%。本实验中使用的代表性人类血清被稀释1：20，用于用huRBL细胞孵育，用于刺激的抗原浓度从100微克/mL到Bet v 1的0.004 pg/mL不等。细胞生存能力测定，在这种情况下是MTT检测，在抗原刺激后与剩余细胞一起进行，以评估敏感血清以及抗原稀释对细胞生存能力和细胞计数的影响（E）。未经处理的背景细胞和裂解细胞（最大裂解）显示为虚线。请单击此处查看此图的较大版本。 图2：代表曲线的β-六氧三恶三叶草百分比释放五个不同的人类塞拉。 rBet v 1 的相同抗原浓度范围与不同白木花粉敏感个体的塞拉一起培养。不同患者之间释放的百分比明显不同，这与症状的严重程度相对应。请注意，患者 #5 对主要的白杨花粉过敏原 Bet v 1 没有反应。所有五个用于获得这些介质释放曲线的人类血色素均被稀释1：20，用于与huRBL细胞的孵育。 请单击此处查看此图的较大版本。 图3：来自白木花粉敏感患者的IgE的交叉反应与Bet v 1同源粽子过敏原Cor a 1。 两个有代表性的患者对白木花粉敏感， 对 Bet v 1 的强烈反应， 以及对同源过敏原 Cor a 1 的较小程度的反应。患者 2 显示对 Cor a 1 的显著反应，因此在粽子消耗时可能会表现出口腔过敏症状，而患者 1 的调解释放几乎可以忽略不小。虚线表示无抗原控制，这种控制是细胞对人体血清敏感，但不会受到过敏原的刺激，因此，作为底部信号高原/背景的指示。 请单击此处查看此图的较大版本。 图4：rBet v 1野生类型与低过敏性折叠变种之间百分比释放的比较。 同一种白木花粉敏感个体的血清与rBet v 1野生类型（wt）和主要白木花粉过敏原（A）的低过敏性折叠变异一起孵育。尽管介导器释放在两种抗原中都可以看到，但在将折叠变异与野生类型 rBet v 1 进行相同百分比释放时，反原浓度明显转向较高。比较不同抗原百分比释放百分比差异的标准方法是计算达到半最大释放（B）所需的抗原浓度。这通常在生物复制中执行（测试不同人类血色中的每个过敏原的相同抗原范围）。通常，为了得出任何重要的结论，调解人释放是与塞拉从至少8至10个不同的患者进行。在这里，四个不同的塞拉的结果被绘制为一个例子。用于统计分析的配对 t测试。*p ≤ 0.05;**p ≤ 0.01;p ≤ 0.001：p ≤ 0.0001。 请单击此处查看此图的较大版本。 潜在问题和故障排除 溶液 由于细胞响应性改变，检测到检测的变异性 确保单元格通过周期数不超过 20 到 30 通道。在早期通道上制作冷冻库存，以便将来进行实验。 而不是依靠生物复制（使用不同的塞拉）而不是技术复制。 塞拉含有低水平的特定IgE 可使用较低的最终血清稀释（即 1：10）而不是 1：20。相反，含有高浓度特定IgE的塞拉可以进一步稀释（1：30或1：40）。 没有足够的细胞进行检测 确保 T-75 烧瓶中的汇流在 50-90% 左右。通过更多的烧瓶。 塞拉的细胞毒性作用，即由于不完全的补充灭活 除了调解人释放分析之外，还执行细胞生存能力分析。增加 Ag8 浓度，以避免不完全的补充灭活。 低信号 通过稀释氧化二氮 （D2O） 中的 1 倍 Tyrode 缓冲，而不是 dH2O，或使用具有较高特定 IgE 水平的血红素来稀释特定 IgE 的检测信号与噪声比，从而改善检测结果。 泰罗德缓冲区（例如降水）中的过敏原不稳定 在检测程序之前，在 1x Tyrode 的缓冲器中进行稳定性测试。不建议替换泰罗德的缓冲器。 找到各自过敏原正确启动浓度的问题 稀释系列的适应，以覆盖完整的释放曲线（更多的稀释步骤，1：20稀释，而不是1：10）。 低/无信号表示的检测性能差 避免细胞毒性作用，无论是塞拉或抗原刺激（例如酶过敏原）。小心地清洗和浸泡细胞。避免长时间暴露在空气中，防止细胞干燥。 如何知道是否达到底部信号高原？ 在盘子中添加”无抗原”控件。这些是敏感细胞，只有1倍泰罗德的缓冲刺激，但没有过敏原。 除了最大的裂解井之外， 我还需要积极的控制吗？ 作为额外的阳性控制，可以使用血清和抗原组合，已知会导致脱粒或抗 FcéR1 抗体。 我需要多少口井？ 这取决于你的点子系列，你想分析的抗原和塞拉的数量。 根据要测试的塞拉/抗原量，规划 96 井板的布局。不要忘记添加”无抗原控制”，背景细胞（无敏感，非刺激）以及最大的裂解井。 我应该测试多少塞拉？我需要复制吗？ 虽然检测相当稳健，但由于细胞响应性改变，检测到检测的变异性也有所变化。因此，建议它宁愿依靠生物复制（使用不同的塞拉），而不是依靠技术复制。至少八种不同的塞拉足以分析过敏原。但是，如图 4B 所示，已经可以使用更少的塞拉获得显著结果。 表1：故障排除。