JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Выделение врожденных лимфоидных клеток матки для анализа методом проточной цитометрии

Published: October 14, 2021
doi:
10.3791/62670
, , , , ,
1Department of Obstetrics and Gynaecology, National Institute for Health Research Cambridge Biomedical Research Centre,University of Cambridge School of Clinical Medicine, 2Centre for Trophoblast Research,University of Cambridge

Summary

Это метод выделения лимфоидных клеток матки как от беременных, так и от небеременных мышей. Этот метод может быть использован для нескольких последующих приложений, таких как фенотипирование FACS, сортировка клеток, функциональные анализы, РНК-seq и протеомика. Протокол здесь демонстрирует, как фенотип группы 1 врожденных лимфоидных клеток матки методом проточной цитометрии.

Abstract

Здесь описан простой метод выделения и фенотипа мышиной группы 1 врожденных лимфоидных клеток матки (g1 uILCs) из отдельной беременной матки методом проточной цитометрии. Протокол описывает, как настроить время спаривания для получения нескольких синхронных дамб, механическое и ферментативное сбраживание беременной матки, окрашивание одноклеточных суспензий и стратегию FACS для фенотипирования и дискриминации g1 uILC. Хотя этот метод неизбежно теряет пространственную информацию о клеточном распределении внутри ткани, протокол был успешно применен для определения гетерогенности uILC, их реакции на материнские и плодные факторы, влияющие на беременность, их профиля экспрессии генов и их функций.

Introduction

Здесь описан простой метод получения высокого выхода врожденных лимфоцитов матки из отдельной беременной матки. Этот метод сохраняет поверхностную экспрессию белка и функциональность врожденных лимфоцитов матки и подходит для последующих применений, таких как фенотипирование FACS, RNAseq, протеомика или функциональные анализы. Здесь основное внимание уделяется фенотипированию uILC группы 1 с помощью проточной цитометрии.

Матка состоит из трех слоев: эндометрия, миометрия и периметрия (рисунок 1). Эндометрий – это слизистая оболочка, выстилающая просвет матки. Прогестерон, вырабатываемый желтым телом, превращает эндометрий в децидуа. Миометрий состоит из двух слоев гладких мышц, которые составляют стенку матки. Периметрий – это сероза, которая обертывает матку и соединяет ее с брюшиной через широкую связку, называемую мезометрием. В поперечном сечении матки часть, противоположная просвету, называется мезометрической стороной, в то время как часть, близкая к просвету, называется антимезометрической стороной. Различные материнские лейкоциты населяют эндометрий и децидуа, включая несколько типов клеток, где врожденные иммунные клетки представляют подавляющее большинство клеток. Врожденные лимфоидные клетки (ILC), макрофаги, дендритные клетки (DC), а также CD4 + и CD8 + Т-лимфоциты, регуляторные Т-клетки (Tregs) и редкие В-клетки могут играть важную роль в регуляции среды матки на протяжении всей беременности1,2. ИЛК в матке обнаруживаются не только в слизистой оболочке, но и в миометрии у мышей. Включая все три группы ILC, матка действительно является органом, наиболее густонаселенным ILC группы 1. При структурной трансформации тканей матки на протяжении всей беременности количество и доля лейкоцитов матки также изменяются (см. Рисунок 2А для примера вариаций в процентном соотношении подмножеств uILC группы 1)3,4.

Когда мыши упоминаются в этой статье, имеется в виду штамм C57BL/6 инбредных лабораторных мышей. Бесподные мыши (например, мыши СМПРТ) часто используются в репродуктивных исследованиях из-за их высокой репродуктивной скорости. Тем не менее, использование инбредных штаммов необходимо для получения последовательных результатов, и любимым генетическим фоном иммунолога является C57BL / 6, также известный как B6.

Приблизительно 30% лейкоцитов матки в плотинах B6 в середине беременности являются g1 uILCs, которые определяются проточной цитометрией как жизнеспособные cd45 + CD3-CD19-NK1.1 + NKp46 + клетки (рисунок 2B): проангиогенные тканевые резидентные NK (trNK), IFN-g, продуцирующие обычный NK (cNK), и uILC14,5. Процент клеток uNK еще выше у людей, достигая около 70% в первом триместре6. Существует больше сходств, чем различий между человеческим и мышиным uNK и uILC7,8. Хотя важно помнить о различиях, полезно интегрировать имеющуюся информацию о двух видах. Если объединить информацию, полученную в результате исследования uILC у людей и лабораторных грызунов, становится ясно, что NK-клетки помогают в гомеостатических изменениях, необходимых для биологии матки, включая поддержание целостности артерий9 и ремоделирование спиральных артерий10, а также инвазию трофобластов11,12. Они также играют определенную роль в защите от патогенов13,14. У мышей и крыс, помимо заполнения децидуа вокруг места имплантации, NK-клетки накапливаются между двумя мышечными слоями миометрия плотин в переходной структуре, известной как мезометриальная лимфоидная совокупность беременности (MLAp)15 (рисунок 1B), также известная в прошлом как метриальная железа, функция которой еще не обнаружена.

Здесь описан подробный протокол метода, применяемого в лаборатории для выделения лимфоцитов из матки беременных мышей с использованием комбинации механической дезагрегации и ферментативного пищеварения. Поскольку в методе используется вся матка, лимфоциты, выделенные из матки во время вынашивания плода, представляют собой смесь децидуальных и миометриальных клеток. Возможно дальнейшее рассечение децидуа из стенки матки и его ОМП, и это было описано ранее16. Описанный здесь способ был разработан для получения маточных лимфоцитов при сохранении поверхностной экспрессии белка, клеточной функциональности и жизнеспособности. Результатом является одноклеточная суспензия с минимальным остаточным клеточным мусором и выходом, обычно варьирующимся от 1-5 миллионов клеток в середине беременности (10,5 дней) для беременной матки. Применение этого метода включает фенотипирование с помощью проточной цитометрии, сортировку клеток для последующих транскриптомных или протеомных исследований, функциональные исследования, такие как внутриклеточная цитокиновая продукция, дегрануляция, ELISPOT или цитотоксические анализы. Протокол, представленный здесь, фокусируется на идентификации ILC группы 1, но может быть адаптирован для других типов клеток, таких как другие ILC, Т-клетки, В-клетки, DC или макрофаги с незначительными модификациями панели антител, используемой для анализа FACS. Протокол также может быть использован для выделения клеток из других тканей и для объединенных небеременных матк.

Protocol

Все эксперименты на животных, описанные в этой статье, были проведены в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) 1986 года в соответствии с PP2363781, выпущенным Министерством внутренних дел Великобритании. Приведенный ниже протокол состоит из нескольких разделов, начиная от разведения мышей и заканчивая окрашиванием для анализа FACS. На рисунке 3 показаны основные этапы протокола. Материалы, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов. 1. Общее разведение, спаривание и рассечение мышей Держите 7-14-недельных самок мышей в специфических условиях без патогенов (SPF) и в группе (обычно 4-6 самок в зависимости от размера клетки и веса животного) в течение 10-14 дней, чтобы вызвать эффект Ли-Бута, что приводит к синхронизации течки17. Держите самцов конюшни в условиях SPF, в одиночку и отдыхайте не менее 48 ч между каждым спариванием (время регенерации сперматозоидов). Предпочтительно использовать опытных проверенных 3-4-месячных самцов, так как они, как правило, более производительны, чем молодые. Чтобы увеличить вероятность того, что самки забеременеют, введите загрязненную подстилку из клетки самца в женскую клетку за 3 дня до спаривания. Это вызывает эффект Уиттена18 при воздействии мужских феромонов мочи и приводит к синхронизированной течке, а также к повышению восприимчивости к спариванию. В день 0 (D0) настройте мышей на спаривание, используя одного самца конного завода на двух самок; Рассмотрим скорость вилки примерно 20%-25%.ПРИМЕЧАНИЕ: Спаривание, скорее всего, будет происходить ночью, так как мыши являются ночными животными. Утром после спаривания (D0.5) проверьте наличие влагалищной пробки, которая является показателем совокупления (рисунок 4). Вагинальная пробка представляет собой совокупность мужского эякулята и обычно сохраняется до 8-24 ч после спаривания. Проверьте пробки рано утром. Консолидируйте закупоренных самок в новой клетке и выделите их. Верните самцов в их клетки для отдыха. При D9,5 или 10,5-после спаривания подготовьте 5 мл пробирок с 1 мл стерильным HBSS 1x (с Mg2+ и Ca2+) для сбора тканей и поместите их на лед. Приступают к эвтаназии животных путем вывиха шейки матки с последующим экссангинацией для подтверждения смерти. Работайте в стерильной среде, если этого требует последующее приложение. Непосредственно после эвтаназии протрите тело мыши 70% этанолом и приступайте к рассечению под ламинарным флюсовым шкафом со стерильными инструментами. Рассекните беременную матку, свободную от мезометриального жира (рисунок 5), и поместите всю матку в подготовленную и соответствующим образом маркированную трубку объемом 5 мл. Держите трубки на льду. 2. Механическое и ферментативное сбраживание матки Для приготовления ферментативного раствора для пищеварения смешайте 3 мл на матку стерильного HBSS 1x с 30 мкг/мл DNAse и 0,1 единицы Wünsch (WU)/мл Liberase DH или 0,52 WU/мл Liberase TM. Поместите раствор на водяную баню при температуре 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать как Liberase TM, так и Liberase DH. При выборе одного над другим необходимо руководствоваться их потенциальным воздействием на эпитопы, распознаваемые антителами, используемыми для последующего анализа проточной цитометрии.ВНИМАНИЕ: При использовании лиофилизированных ферментов работайте под капотом. Приготовьте 20 мл 5 мМ ЭДТА в PBS (без Ca2+/Mg2+). Половину раствора поместить при 37 °C на водяную баню, а другую половину на лед. Под шкафом ламинарного флюса аккуратно удалите жир, окружающий матку беременной, стерильными инструментами в стерильной чашке Петри. Не допускайте высыхания ткани. Рассекните каждый участок имплантации стерильными инструментами для удаления плодов (полупрозрачная структура в форме морского конька, около 1 мм в длину) (рисунок 6А). Выбросьте плоды. Верните матку в их первоначальную коллекционную трубку 5 мл и измельчите ткань с помощью ножниц непосредственно в пробирке 5 мл и среде сбора. Держите трубки на льду все время между процедурами. Поместите пробирки объемом 5 мл, содержащие измельченную ткань, на водяную баню при температуре 37 °C. Добавьте в каждый образец 3 мл теплой ферментативной смеси для пищеварения, чтобы общий объем жидкости в пробирке составлял 4 мл (1 мл сбора среды с измельченной маткой и 3 мл ферментативного раствора для пищеварения). Инкубировать пробирки 5 мл в течение 30 мин при 37 °C с перемешиванием для усиления ферментативной активности пищеварения. Вращайте трубки по 5 мл и поместите их на лед, чтобы ингибировать действие ферментов. Затем, впоследствии, перенесите содержимое в правильно маркированные 15 мл центрифужные трубки. Смывайте все из 5 мл пробирок в центрифужные трубки объемом 15 мл, используя 10 мл ледяного 5 мМ раствора EDTA PBS. Центрифугирование 15 мл центрифужных пробирок, содержащих переваренные ткани, в течение 10 мин при 400 х г. Откажитесь от надосадочного вещества, осторожно щелкните гранулой, а затем повторно суспендируйте ее в 10 мл теплого (37 °C) 5 мМ раствора EDTA PBS. Инкубируют образцы в 15 мл центрифужных пробирках при 37 °C с перемешиванием в течение 15 мин, чтобы удалить оставшуюся среду пищеварения и уменьшить слипание клеток. Вихрь образцов на высоте в течение 10 с, чтобы еще больше облегчить диссоциацию тканей. 3. Переработка матки в одноклеточную суспензию Используя поршень стерильного шприца объемом 1 мл, нагнетайте переваренную ткань через ситечко 70 мкм на правильно маркированную и стерильную центрифужную трубку объемом 50 мл для удаления клеточных сгустков и недиссоциированной ткани. Промыть ситечко несколько раз, в общей сложности 10 мл холодного PBS, чтобы собрать все клетки. Открутите трубку центрифуги объемом 50 мл в течение 10 мин при 400 х г.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните дальнейшие шаги с использованием варианта А или варианта В. Вариант А позволяет лучше обогащать лимфоциты меньшим количеством мусора и загрязнения стромальных клеток, чем вариант В. Тем не менее, вариант B дает более высокий выход иммунных клеток из-за меньшей потери клеток и меньшей изменчивости выхода клеток между образцами. Вариант B также легче выполнить технически. Поэтому, в зависимости от предпочтений, переходите к варианту A или варианту B. Для варианта А необходимо выполнить следующие действия. Маркировать одну стерильную 15 мл центрифужную трубку на образец, содержащую 5 мл 80% (v/v) изотонического Percoll, разбавленного в PBS. После отжима выбросьте супернатант из трубки центрифуги объемом 50 мл. Используйте пипетку для повторного суспендирования каждой гранулы в 8 мл 40% (v/v) изотонического Percoll в PBS. Используйте пипетку на медленной скорости, чтобы аккуратно наложить гранулу, повторно суспендированную в 40% растворе Перколла, на 80% раствор Перколла. Пипетка медленно и непрерывно; удерживать трубку объемом 15 мл под углом 45° (рисунок 6B). Не нарушая накладки, центрифугируйте трубки центрифуги объемом 15 мл в течение 20 мин при 850 х г, при комнатной температуре (среднее ускорение и минимальный разрыв). Осторожно извлеките трубки из центрифуги, не нарушая слои Перколла (рисунок 6C). Не нарушая кольцо лейкоцитов на границе раздела двух растворов Перколла, используйте стерильную пипетку Пастера, чтобы выбросить все, кроме примерно 0,5-1 мл верхнего слоя Перколла. При попытке всасывать минимальное количество раствора Перколла (всего до 4-5 мл), тщательно соберите кольцо лейкоцитов и перенесите клетки в новую меченую 15 мл центрифужную трубку. Пополните каждый образец 10 мл стерильной среды RMPI-1640, дополненной 10% термоинактивированной FBS. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г при 4 °C. Выбросьте супернатант и приступайте к лизису RBC. Для варианта B необходимо выполнить следующие действия. Маркировка одной стерильной пробирки центрифуги объемом 15 мл на образец. После отжима выбросьте супернатант из трубки центрифуги объемом 50 мл. Используйте пипетку для повторного суспендирования каждой гранулы с 8 мл 35% (v/v) изотонического Percoll в среде RPMI-1640. Перенесите образцы в центрифужные трубки объемом 15 мл. Центрифугирование образцов при 940 х г в течение 10 мин при комнатной температуре со средним ускорением и минимальным разрывом. Аспирируйте супернатант осторожно, используя аспиратор или пипетку мальчика (не переворачивая трубку). Повторно суспендируют гранулу в 14 мл среды RPMI-1640, дополненной 10% термоинактивированным FBS, а затем центрифугируют образец при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Отбросьте супернатант путем аспирации и приступайте к лизису RBC. 4.Лизис РБК Для лизирования эритроцитов повторно суспендируют образцы в 3 мл 1x раствора RBC и инкубируют в течение 3 мин при комнатной температуре. Добавьте 10 мл PBS в образцы, чтобы остановить реакцию. Центрифугируйте пробирки при 400 х г в течение 5 мин и выбросьте супернатант. Добавьте 10 мл PBS и повторите шаг 4.3. Повторно суспендировать каждую гранулу в 1 мл среды RPMI-1640, дополненной 10% термоинактивированной FBS. Пропускайте образцы через стерильные клеточные ситечки 70 мкм. Выполните подсчет клеток, используя трипан синий и камеру Neubauer в соответствии с инструкциями производителя. Отрегулируйте концентрацию клеточной суспензии до 1-2 млн клеток в 100 мкл PBS или среды. 5. Стратегия проектирования панелей и элементы управления ПРИМЕЧАНИЕ: Панель, описанная в этой статье, подходит для дискриминации клеток uILC1, trNK и cNK и была разработана для использования на 5-лазерном BD LSRFortessa. Незначительные изменения могут быть сделаны для изучения различных клеточных популяций и использования альтернативных фторхромов. Рекомендуется проверить конфигурацию прибора, используя титрованные антитела для оптимального разделения, консультируясь с индексом яркости производителя и используя самые яркие красители для низкоэкспрессирующих антигенов, таких как NKp46, и следуя общим рекомендациям19. Рекомендуется включить флуоресцентный минус один (FMO) элемент управления для NKp46. 6. Окрашивание врожденных лимфоидных клеток для фенотипирования FACS Переведите 1-2 миллиона клеток на скважину в круглодонную 96-луночную пластину. Раскрутите пластину при 400 х г в течение 3 мин при 4 °C и выбросьте супернатант, щелкнув его в раковину. Повторно суспендируйте клеточные гранулы в 100 мкл PBS (без белка и азида) с помощью многоканальной пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что PBS не содержит азида натрия, триса или каких-либо белков для последующей стадии. Повторите шаг 6.2. Повторное суспендирование клеток в 50 мкл поправимого красителя жизнеспособности, разбавленного в PBS (без белка и азида) (1:1000). Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что PBS не содержит азида натрия, триса или любых белков, таких как FBS или BSA, поскольку это может привести к снижению интенсивности окрашивания мертвых клеток и / или увеличению фонового окрашивания для живых клеток.ВНИМАНИЕ: Если краситель жизнеспособности порошкообразный, используйте под капотом. Добавьте 150 мкл PBS, повторно суспендируйте ячейки многоканальной пипеткой, а затем повторите шаг 6.2. Повторное суспендирование клеток в 25 мкл буфера FACS (PBS, дополненного 1% BSA или 2% FBS), содержащего реагент, блокирующий fc-рецепторы. Инкубировать клетки в течение 5 мин при 4 °C. Добавьте 25 мкл поверхностного коктейля антител.ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда титруйте антитела и оптимизируйте панель антител до начала эксперимента. Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 20 мин в темноте. Добавьте 150 мкл FACS Buffer в каждую лунку, тщательно перемешайте, а затем повторите шаг 6.2. Повторите шаг 6.10.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните дальнейшие действия, используя вариант A или вариант B. Используйте вариант A для окрашивания ячеек маркерами поверхности. Используют вариант В для исследования внутриклеточных маркеров методом проточной цитометрии. Для варианта А необходимо выполнить следующие действия. Повторно суспендируют образцы в 100 мкл 4% параформальдегида (PFA) на лунку и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре.ВНИМАНИЕ: Используйте PFA под капотом. Пожалуйста, обратитесь к паспорту безопасности для безопасного выбрасывания отходов/предметов PFA, которые вступили в контакт с PFA (например, пипетки). Повторите шаг 6.2 дважды.ВНИМАНИЕ: Не выбрасывайте, вставляя в раковину здесь, так как она содержит PFA. Аспирировать пипеткой и выбросить отходы в соответствии с листом безопасности. Повторное суспендирование образцов в 200 мкл PBS. Переложите образцы в маркированные пробирки FACS и залейте 100 мкл PBS. Храните трубки на льду или в холодильнике до обработки анализом FACS. Возьмите образцы на проточном цитометре в течение 24 ч. Для варианта B необходимо выполнить следующие действия. Повторно суспендируют образцы в 100 мкл раствора фиксации/пермеабилизации на лунку (содержащую параформальдегид) и инкубируют в течение 20 мин при 4 °С.ВНИМАНИЕ: Используйте PFA под капотом. Пожалуйста, обратитесь к паспорту безопасности для безопасного выбрасывания отходов/предметов PFA, которые вступили в контакт с PFA (например, пипетки). Повторите шаг 6.2.ВНИМАНИЕ: Не выбрасывайте, вставляя в раковину здесь, так как она содержит PFA. Аспирировать пипеткой и выбросить отходы в соответствии с листом безопасности. Добавьте 200 мкл 1x буфера пермеабилизации / промывки, хорошо перемешайте, а затем повторите шаг 6.2. Повторите шаг 6.11.2.3. Повторное суспендирование фиксированных и пермеабилизированных клеток в 50 мкл 1x буфера пермеабилизации/промывки, содержащего смесь антител для внутриклеточного окрашивания. Инкубируйте образцы при 4 °C в течение 30 мин в темноте. Добавьте 200 мкл 1x раствора для пермеабилизации/ промывки, хорошо перемешайте, а затем повторите шаг 6.2. Повторите шаг 6.11.2.7. Повторное суспендирование образцов в 200 мкл PBS. Переложите образцы в маркированные пробирки FACS и залейте 100 мкл PBS. Храните трубки на льду или в холодильнике до обработки анализом FACS. Возьмите образцы на проточном цитометре в течение 24 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: После выполнения этого протокола децидуальная клеточная суспензия готова к анализу FACS. Рекомендуется записывать как можно больше событий на выборку; для достижения достоверных результатов необходимо получить не менее 1000-3000 событий родительского населения.

Representative Results

Основные этапы способа, которые описаны для получения одноклеточной суспензии лейкоцитов матки, обобщены на рисунке 3. На рисунке 2B показана базовая стратегия гатинга FACS, используемая для идентификации трех подмножеств G1 ILC у мышей B6: клеток uILC1 (CD49a + Eomes-), trNK (CD49a + Eomes +) и cNK (CD49a-Eomes +). Дальнейший анализ этих популяций может быть выполнен для изучения различных поверхностных и внутриклеточных маркеров g1 ILC. Например, коэкспрессия рецепторов IFN-ɣ и self-MHC может быть оценена в клетках uILC1, trNK и cNK после стимуляции антителом против NK1.1 (рисунок 7). В зависимости от вопроса исследования могут быть адаптированы как протокол (рисунок 3), так и панель антител. Важно отметить, что рекомендуется использовать как анти-NK1.1, так и анти-NKp46 антитела в одной панели FACS для g1 ILC g1 (рисунок 2B и таблица 1). Следует отметить, что G1 ILC, полученные из крови, селезенки или печени, имеют более высокую экспрессию NKp46 на своей поверхности, чем маточный аналог (рисунок 8). Окрашивание поверхности для NK1.1 обеспечивает лучшее разделение и позволяет легко закрывать ILC g1 матки (рисунок 8). В то время как NKp46 экспрессируется всеми штаммами мышей, антиген NKR-P1C, распознаваемый антителом PK136 против NK1.1, экспрессируется только некоторыми штаммами мышей, включая C57BL/6 (т.е. B6), FVB/N и NZB, но не в AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL или 129. Кроме того, если исследователь намерен изучить важнейшие рецепторы NK-клеток, такие как рецепторы MHC Ly49, важно знать об аллельных вариациях в лабораторных штаммах мышей, которые повторяют высокую вариабельность иммуноглобулиноподобных рецепторов-киллеров человека (KIR). Более того, если клетки должны стимулироваться NK1.1 для функционального анализа, как описано в Kim, S. et al.20, может быть желательно окрашивать клетки анти-NKp46, а не анти-NK1.1, так как антиген NKR-P1C может быть занят сшивающим анти-NK1.1 или рецептор может следовать за стимуляцией. Либо поглощенность рецепторов, либо пониженная регуляция могут препятствовать окрашиванию тем же антителом, которое используется для стимуляции. Распространенной проблемой диссоциации ферментативной ткани является изменение поверхностных эпитопов на клетках ферментами, используемыми для среды пищеварения. Например, окрашивание для рецептора MHC CD94:NKG2A является плохим, если используется Liberase TM. Однако пищеварение с Liberase DH сохраняет распознавание NKG2A клоном антитела 16A11 (рисунок 9). Рекомендуется проверить влияние ферментов на все эпитопы в своей панели FACS. Для этого используют суспензию мышиных спленоцитов, полученную путем механической диссоциации (пропускания всей селезенки через 70 мкм ситечко). Затем образец разделяют на две или более частей с последующей инкубацией со средой с ферментом (ферментами) или без него. Как упоминалось ранее, клетки, полученные из крови, присутствуют в тканевых диссоциированных образцах. При необходимости загрязняющие вещества крови могут быть исключены с помощью метода внутрисосудистого окрашивания, разработанного в лаборатории Масопуста21. Рисунок 10 показывает, что около 6,5% G1 ILC, присутствующих в образцах тканей матки на 8,5-й день беременности, получены из крови. Анти-CD45 антитела, используемые для внутрисосудистого окрашивания, могут быть конъюгированы с фторхромом, используемым для дампа-канала; это исключит загрязнители крови без использования дополнительного флуоресцентного канала. Наиболее распространенные проблемы и их решения представлены в таблице 2. Рисунок 1: Поперечное сечение матки мыши. (A) Поперечное сечение матки мыши (небеременное), указывающее на разнообразие материнских лейкоцитов, которые населяют матку. (B) Поперечное сечение матки мыши (день беременности 8,5). (C) Поперечное сечение матки мыши (день беременности 13,5). (D) Сравнение образования плаценты мыши и человека от стадии бластоцисты и далее. Изображения, созданные с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Субпопуляции матки g1 ILC1. (A) Процентное содержание маточного cNK, ILC1 и trNK у мышей в раннем возрасте и во время беременности. W – недели, gd – день беременности. Модифицированный график от Filipovic, I. et al.4. (B) Стратегия гатинга для анализа подмножеств ILC группы матки 1 с помощью проточной цитометрии. Лимфоциты выделяли из тканей матки на 10,5 день беременности. Переваривание тканей проводили с использованием среды для пищеварения, содержащей Liberase TM. Клетки были закрыты на основе их способности рассеивать свет. Дублеты были исключены с использованием графика FSC-A против FSC-H, и только CD45 + CD3-CD19- жизнеспособные клетки были проанализированы дополнительно. В CD45+CD3-CD19-жизнеспособных клетках ILC группы 1 был идентифицирован как клетки NK1.1+ NKp46+. В группе 1 ILC могут быть идентифицированы три подмножества: CD49a-Eomes+ обычные NK-клетки (cNK), CD49a + Eomes + тканевые резидентные NK-клетки (trNK) и CD49a + Eomes-uILC1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Визуальное руководство по основным шагам протокола. (1) Рассечение матки беременной без мезотриального жира. (2) Удалить плоды; вернуть матку в пробирку объемом 5 мл и измельчить ткань. Приступайте к этапу переваривания ферментов: добавьте 3 мл теплой ферментативной смеси для пищеварения в каждый образец. Инкубировать пробирки по 5 мл в течение 30 мин при 37 °C с перемешиванием. (3) (i) После пищеварения смойте все из 5 мл пробирок в пробирки по 15 мл, используя 10 мл ледяного 5 мМ раствора EDTA PBS. ii) Центрифуги 15 мл пробирки, содержащие переваренные ткани в течение 10 мин при 400 х г. iii) выбросить супернатант; Осторожно смахните гранулу и повторно суспендируйте ее в 10 мл теплого (37 °C) 5 мМ раствора EDTA PBS. iv) Инкубировать образцы в пробирках объемом 15 мл при 37°С с перемешиванием в течение 15 мин. (4) Используя поршень стерильного шприца объемом 1 мл, форсируйте переваренную ткань через ситечко 70 мкм на правильно маркированную и стерильную трубку объемом 50 мл и вращайте в течение 10 минут при 400 х г. (5) После отжима перейдите к варианту A (представленному здесь на диаграммах) или B. Вариант A: выбросьте супернатант из трубки объемом 50 мл и, используя пипетку, повторно суспендируйте каждую гранулу в 8 мл 40% (v/v) изотонического Percoll в PBS. (6) i) Вариант А продолжение: Используя пипетку на медленной скорости, осторожно накладывайте гранулу, повторно суспендированную в 40% растворе Перколла, на 5 мл 80% раствора Перколла. Пипетка медленно и непрерывно; удерживать трубку объемом 15 мл под углом 45°. ii) Не нарушая накладки, центрифугировать трубки объемом 15 мл при температуре 850 х g в течение 20 мин при комнатной температуре со средним ускорением и медленным разрывом. (7) После отжима, пытаясь высосать минимальное количество раствора Перколла (всего до 4-5 мл), тщательно соберите кольцо лейкоцитов. (8) Выполните этапы лизиса эритроцитов. (9) Подсчитайте ячейку, используя трипан синий и камеру Нойбауэра. (10) Перенесите 1-2 миллиона клеток на скважину в круглодонную 96-луночную пластину. (11) Приступайте к окрашиванию красителем жизнеспособности и антителами. (12) Наконец, перенесите образцы в маркированные пробирки FACS. Храните трубки на льду или в холодильнике до обработки анализом FACS в течение 24 ч. Изображения, созданные с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Вагинальная пробка (A) и ее отсутствие (B) у самок C57BL/6 через 0,5 дня после спаривания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Рассечение для извлечения матки у беременной мыши. (А) Плотина зажимается иглами на мягкой доске, чтобы протереть тело 70% этанолом. Сделаны два вертикальных разреза, на что указывают синие пунктирные линии. (B) Кожа подтягивается для обнажения внутренних органов. Кишечные петли осторожно перемещаются вверх, чтобы визуализировать матку. (C) Матка отбирается путем разрезания в трех точках: рядом с яичниками и на шейке матки, о чем свидетельствуют две синие пунктирные линии и синяя стрелка, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Приготовление одноклеточной суспензии. (А) Механическое удаление эмбрионов из места их имплантации. B) наложение градиента Перколла; верхний слой содержит одноэлементную суспензию в 40% Перколла, а нижний слой в 80% Перколла. (C) Образование кольца лимфоцитов после центрифугирования градиента перколла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7: Репрезентативный анализ FACS функционального анализа с ILC группы 1. Внутриклеточное обнаружение IFN-ɣ и поверхностного CD107a в ILC группы 1, экспрессирующих NK-рецепторы для само-MHC (Ly49C, Ly49I и NKG2A) по сравнению с теми, которые этого не делают, после сшивания NK1.1 с пластинчатыми антителами. Клетки были выделены из тканей матки на 9,5 день беременности. Тканевое переваривание проводили с использованием среды пищеварения, содержащей Liberase DH. Показаны исходные значения всех четырех квадрантов (углов), а также относительный процент респондентов среди клеток, экспрессирующих рецепторы для себя и респондентов, которые не имеют саморецепторов (жирные числа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 8: Окрашивание селезеночных и маточных лимфоцитов антителами анти-NKp46 и анти-NK1.1. (A) Клеточные суспензии, полученные из мышиной селезенки и (В) матки на 10,5-й день беременности, были разделены на две части; одна деталь была окрашена NKp46-APC (красный), а другая – NK1.1-APC (синий). Обратите внимание, что окрашивание NKp46 лимфоцитов матки не разделяет NKp46+ и NKp46-клетки так же аккуратно, как селезеноциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 9: Снижение NKG2A MFI (клон антитела: 16A11) путем инкубации со средой пищеварения. Клеточная суспензия мышиных спленоцитов C56BL/6 была разделена на три части. Одну часть инкубировали в среде пищеварения Liberase DH (HBSS, содержащей 0,13 WU/mL Liberase DH и 30 мкг/мл DNAse), а другую часть инкубировали со средой пищеварения Liberase TM (HBSS, содержащей 0,52 WU/mL Liberase TM и 30 мкг/мл DNAse). Третью часть обрабатывали аккуратным HBSS в течение 30 мин при 37 °C. Экспрессию маркера NKG2A на ILC g1 оценивали с помощью проточной цитометрии. График взят из Шрива Н. Роль ингибирования NK-клеток матки при беременности (тезисы); Руководитель: Колуччи Ф, 2020. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 10: Прижизненное окрашивание антителами против CD45 для исключения G1 ILC, полученных из крови. Мышь C57BL/6 dam на 8,5-й день беременности отбраковывали через 3 мин после внутривенной инъекции с 3 мкг CD45-AF647. Матка, цельная кровь и тимус были собраны и обработаны для анализа FACS. Ось X показывает сигнал от внутривенного окрашивания CD45-AF647, а ось Y демонстрирует сигнал от окрашенного in vitro CD45-BUV395. Проценты субпопуляций показаны в квадрантах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Антитела / Краситель Клон Фторхром Лазер 1 (канал дампа) Зомби Фиолетовый Поправимый Краситель жизнеспособности Фиолетовый СД19 1Д3 БВ421 СД3 145-2С11 БВ421 2 СД45 30-Ф11 ФИТК Синий 3 НК1.1 ПК136 БВ605 Фиолетовый 4 НКП46 29А1,4 БТР Красный 5 СД49а Ха31/8 БУВ395 Ультрафиолетовый 6 ЭОМЕС Дан11маг ЧП Зеленый Таблица 1: Пример панели FACS для обычного 5-лазерного цитометра. Проблема Возможная причина Предложение Кольцо ячейки не видно на границе раздела двух растворов Перколла Плохое наслоение перколл-раствора или смешивание двух слоев во время обработки образца Будьте особенно осторожны, чтобы не сломать 80% подушку во время наложения. Обратите внимание во время обработки образцов: не нарушайте интерфейс percoll Низкое количество лейкоцитов (например, при использовании небеременной матки) Интерфейс можно увидеть даже тогда, когда номер ячейки на интерфейсе очень низкий. Даже если кольцо не видно, соберите жидкость с содержанием от 40% до 80% растворов, так как все еще может быть достаточно ячеек для дальнейшей обработки. Неполный лизис РБК Клетки не были повторно суспендированы должным образом в буфере лизирования Пипетки вверх и вниз, чтобы сломать сгустки и полностью повторно суспендировать клетки в буфере лизирования Раствор лизирования холодный Уравновешивайте раствор лизирования до комнатной температуры перед использованием Увеличение времени инкубации раствором лизирования до 15мин Стадия лизиса RBC может быть повторена Низкий выход ячеек Плохое ферментативное пищеварение Проверьте, не устарели ли ферменты и не хранились ли они в соответствии с их руководствами Потеря клеток во время этапов промывки Осматривайте ячейку гранулы после каждого этапа промывки: непрозрачные гранулы на дне скважины после отжима. Использование V-образного дна вместо U-образных пластин, центрифуги с поворотным ротором, более длительного времени центрифугирования может снизить потери клеток Образец ткани содержит низкое количество лимфоцитов (например, при использовании небеременной матки) Объедините несколько маток, чтобы получить достаточно событий для анализа. Рассмотрите возможность использования варианта B протокола для изоляции ячеек Высокая вариабельность абсолютных чисел лейкоцитов, полученных у мышей той же группы Непоследовательный сбор ячеек на границе раздела 40% и 80% растворов перколла Убедитесь, что вы собрали целую фракцию ячейки на интерфейсе percoll. Рассмотрите возможность использования варианта B протокола для изоляции ячеек Неспособность обнаружить ожидаемые субпопуляции /маркеры лимфоцитов или необычно низкий MFI для некоторых маркеров клеточной поверхности Ферментативное пищеварение влияет на поверхностную экспрессию некоторых эпитопов или их деградацию Оптимизация ферментативного пищеварения путем изменения: фермента (например, на другой тип либеразы или коллагеназы) и/или продолжительности инкубации и/или концентрации фермента Высокий фоновый шум в проточном цитометре Высокая доля клеточного мусора или загрязнения эритроцитами Настройте пороговый параметр FSC. Рассмотрите возможность использования варианта A протокола для изоляции ячеек Таблица 2: Руководство по устранению неполадок.

Discussion

Метод содержит несколько критических шагов, обсуждаемых ниже. Первым критическим шагом является получение многоплодной синхронной беременности по мере изменения относительной частоты популяций лейкоцитов во время беременности. Наличие нескольких плотин в один и тот же гестационный день позволяет либо биологические повторы в одних и тех же экспериментах, либо объединять лимфоциты из отдельных плотин для получения большего количества, необходимого для последующих применений. Временное спаривание позволяет исследователю точно определить зачатие в течение 24-часового периода. Хотя мыши живут около 2,5 лет, они будут репродуктивного возраста от 4-7 недель до 6-8 месяцев. Поскольку молодые мыши обычно производят более мелких детенышей, самки мышей, как правило, не спариваются, пока им не исполнится 6-8 недель, а самцы мышей до тех пор, пока им не исполнится 8-10 недель. Учитывая, что течка длится около 15 ч у мышей и происходит каждые 4-5 дней, типичная скорость спаривания (выявляется влагалищной пробкой, см. Рисунок 4) составляет около 25%. Поэтому важно использовать мышей при течке и планировать достаточное количество, чтобы получить необходимое количество плотин для данного эксперимента. Фазу цикла течки можно определить по цитологии влагалищного мазка22. Скорость пробки может быть улучшена путем отдыха самцов за 48 часов до спаривания и использования эффекта Уиттена18. В качестве альтернативы можно вводить беременной кобыльей сыворотке, которая имитирует действие эндогенного фолликулостимулирующего гормона, индуцирующего созревание ооцитов и, через 42-50 ч, хорионического гонадотропина человека, который имитирует действие эндогенного лютеинизирующего гормона, индуцирующего овуляцию. Это гормональное лечение обходит потребность в течке и делает практически всех обработанных женщин восприимчивыми.

Вторым важным шагом является обеспечение качества окрашивания СУИМ. Антитела, используемые в проточной цитометрии, всегда должны титроваться и использоваться в оптимальной концентрации, и необходимо проверить, что ферментативное пищеварение не расщепляет важнейшие антигенные эпитопы. Чтобы оценить, будет ли фермент расщеплять эпитоп, можно окрасить две фракции одного и того же образца параллельно, одна из которых подвергается ферментативному, а другая механическому пищеварению. Аналогичным образом, использование соответствующих элементов контроля и одиночных пятен имеет решающее значение для получения надежных данных. Для редких случаев бусины могут быть использованы для создания одиночных образцов пятен. Рекомендуется использовать не бусины для установки напряжений, а скорее популяцию клеток, содержащих лимфоциты и другие лейкоциты, такие как спленоциты. Если используются бусины, необходимо титровать антитела для окрашивания бусин, поэтому интенсивность флуоресценции окрашенных шариков будет сопоставима с интенсивностью флуоресценции клеток. В случае трудностей с отделением положительных клеток от отрицательных для конкретного маркера, контроль FMO также может быть использован для облегчения захвата для конкретного маркера. В случае внутриклеточных маркеров необходимо использовать контроль изотипа, поскольку внутриклеточное окрашивание может привести к остаточным несвязанным антителам, которые все еще могут присутствовать в клетках после этапов промывки и, следовательно, увеличивать фоновый сигнал. Рекомендуется запускать образцы в течение 24 ч после фиксации клеток для получения наилучших результатов фенотипирования с помощью анализа FACS, поскольку автофлуоресценция значительно увеличивается с течением времени, а интенсивность флуоресценции некоторых антител может со временем снижаться.

Другим решающим фактором, который следует учитывать, является последующее применение одноэлементной суспензии, полученной с помощью протокола. Для функциональных анализов важно работать в стерильных условиях. Аналогично, для последующих исследований омики важно работать в стерильных и РНКазных, ДНКазных и протеазных.

Протокол, представленный здесь, фокусируется на фенотипирующих ILC группы 1, но может быть адаптирован для фенотипирования других типов клеток путем модификации панели антител. Рекомендуется, чтобы все антитела были протестированы против переваренной и непереваренной клеточной суспензии, чтобы обнаружить потерю / изменение поверхностных эпитопов с помощью ферментативного лечения. Точно так же различные ферменты могут быть использованы для переваривания ткани и увеличения выхода клеток, но его влияние на важнейшие антигенные эпитопы должно быть тщательно изучено. В то время как NKp46 является хорошим маркером для селезеночных NK-клеток и работает во всех штаммах лабораторных мышей, экспрессия NKp46 на uNK-клетках у мышей C57BL/6 значительно ниже, чем на NK-клетках селезенки. Лучше всего окрашивать как для NK1.1, так и для NKp46 одновременно. Если несколько органов должны быть сопоставлены напрямую, рекомендуется рассматривать все образцы одинаково, даже если ферментативное пищеварение не требуется для таких тканей, как селезенка или костный мозг. Хотя метод, представленный здесь, применим к небеременной матке, выделение кольца лимфоцитов двухфазным градиентом Перколла будет сложным, а выход изолированных клеток может быть слишком низким для надежного анализа FACS и, следовательно, потребует объединения клеток, изолированных из матки отдельных, небеременных мышей23.

Существуют ограничения протокола, которые следует учитывать при интерпретации данных. Как и в случае со всеми тканями, циркулирующие лимфоциты, поступающие из крови, будут изолированы вместе с клетками-резидентами ткани. Если исключение циркулирующих лимфоцитов имеет важное значение для интерпретации данных, прижизненное окрашивание может быть выполнено для маркировки циркулирующих клеток. Кроме того, вторым ограничением протокола является то, что некоторые клетки будут потеряны, поскольку не все клетки могут быть извлечены из ткани. Наиболее распространенные проблемы и их устранение представлены в таблице 2.

Исторически сложилось так, что изучение клеток в тканях опиралось на гистологическое исследование тканевых срезов. Превосходный обзор Сандры Пил24 суммирует работу, проделанную за более чем 100 лет до конца 80-х годов. Описания клеток, позже известных как uNK-клетки, действительно появляются в рукописях, опубликованных более чем за полвека до того, как лимфоциты были даже обнаружены. Так, до открытия NK-клеток в 1975 году и uNK-клетки были обозначены как материнские гликогенные клетки или гранулированные клетки метриальной железы. Энн Крой внесла большой вклад в эту область25 и любезно научила команду рассечению, которое она оптимизировала3, и это используется в настоящее время. Хотя он играет важную роль в описании морфологии и расположения тканей клеток uNK, классическое гистологическое исследование ограничено обнаружением только нескольких маркеров на интересующих клетках. В 2008 году был описан метод одновременного обнаружения нескольких маркеров на лимфоцитах матки на основе проточной цитометрии26. По сути, это метод, который был описан в этой статье. Более поздние технологии, такие как пространственная транскриптомика и визуализация с помощью массовой цитометрии, сочетают в себе силу гистологии и проточной цитометрии, позволяя как одновременно обнаруживать несколько генов или белков, соответственно, так и сохранять нормальную архитектуру ткани.

Приложения метода, описанного здесь, являются множественными и включают фенотипирование FACS, функциональный анализ (такой как ELISPOT, дегрануляция или цитотоксические анализы), сортировку клеток и последующую транскриптомику или протеомику. Дальнейшие приложения, которые могут быть разработаны на основе этого метода, включают культивирование и расширение децидуальных NK-клеток после сортировки или обогащения клеток путем отрицательного истощения. В настоящее время не существует протокола культивирования и расширения мышиных uNK-клеток и сохранения их жизнеспособности и функциональности в течение длительного периода, аналогично человеческим NK-клеткам, которые можно культивировать и расширять в течение 7-14 дней путем добавления IL-2 или комбинации IL-12 и IL-15. Оптимизация такого метода для мышечных uNK-клеток обеспечит большую гибкость при выполнении функциональных анализов и позволит протестировать несколько условий с более высоким числом клеток. С другой стороны, известно, что условия культивирования изменяют уникальный фенотип лимфоцитов и, возможно, их функцию.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим предыдущих и нынешних членов команды, которые помогли разработать этот метод, в том числе Жан-Марка Дуана, Нормана Шрива, Иву Филипович и Аниту Куоллс. Это исследование финансировалось Фондом Wellcome [Номер гранта 200841/Z/16/Z] и Советом по медицинским исследованиям (MR/P001092/1). В целях открытого доступа автор применил публичную лицензию CC BY на авторское право к любой версии принятой автором рукописи, вытекающей из этой заявки.

Materials

70 µm cell strainers Falcon 352350
BSA Sigma A9647-100G
CD19 antibody BD 562701
CD3 antibody BD 562600
CD45 antibody BioLegend 103108
CD49a antibody BD 740262
DNase I Roche (Sigma) 10104159001
EOMES antibody eBioscience 12-4875-82
Fc block Trustain fcx BioLegend 101320
Fetal Bovine Serum Gibco 10217-106
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) BD 554714
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red Gibco 14025092
Liberase DH Roche (Sigma) 5401089001
Lysis buffer Pharmlyse BD 555899
NK1.1 antibody BioLegend 108739
NKp46  antibody BioLegend 137608
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) Agar Scientific AGR1026
PBS 10x Gibco 14030-048
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) Thermo Scientific 14190144
Percoll VWR international 17-0891-01
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK
Pre-Separation filters Miltenyi 130-095-823
RMPI-1640 medium + GlutaMAX Gibco 61870-010
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Scientific 15575020
Zombie Violet Fixable Viability dye BioLegend 423113
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Colucci, F. The immunological code of pregnancy. Science. 365 (6456), 862-863 (2019).
  2. Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. The unique immunological and microbial aspects of pregnancy. Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).
  3. Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. . The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , (2014).
  4. Filipovic, I., et al. Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus. Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).
  5. Chen, Z., et al. DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression. Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).
  6. Moffett, A., Colucci, F. Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).
  7. Gaynor, L. M., Colucci, F. Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice. Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).
  8. Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M. Uterine natural killer cells. Frontiers in immunology. 10, 960 (2019).
  9. Wilkens, J., et al. Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil. The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).
  10. Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).
  11. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  12. Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).
  13. Crespo, &. #. 1. 9. 4. ;. C., et al. Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts. Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).
  14. Shmeleva, E. V., Colucci, F. Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity. Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).
  15. Kather, A., et al. Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus. Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).
  16. Croy, B. A., et al. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods in Molecular Biology. 612, 465-503 (2010).
  17. Vander lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta Physiologica et Pharmacologica Neerlandica. 5 (2), 213-215 (1956).
  18. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
  19. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  20. Kim, S., et al. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules. Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).
  21. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  22. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
  23. Doisne, J. -. M., et al. Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells. Journal of Immunology. 195 (8), 3937-3945 (2015).
  24. Peel, S. Fate of GMG Cells. Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, (1989).
  25. Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones. Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).
  26. Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells. Journal of Immunology. 181 (9), 6140-6147 (2008).

Tags

Uterine Innate Lymphoid CellsFlow CytometryPregnantNon-pregnantLymphocyte IsolationCell ViabilityFetus RemovalEnzymatic DigestionEDTA PBSCell Strainer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Depierreux, D. M., Seshadri, E., Shmeleva, E. V., Kieckbusch, J., Hawkes, D. A., Colucci, F. Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (176), e62670, doi:10.3791/62670 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image