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Ricerca sul cancro

Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62668
, , , , , , ,
1FUJIFILM Wako Bio Solutions Corporation, 2Medical-Industrial Translational Research Center,Fukushima Medical University, 3Department of Bioregulation and Pharmacological Medicine,Fukushima Medical University

Summary

Ein hochgenaues In-vitro-Hochdurchsatz-Assay-System wurde entwickelt, um Krebsmedikamente unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten Tumororganoiden (PDOs) zu bewerten, ähnlich wie Krebsgewebe, aber für In-vitro-Hochdurchsatz-Assay-Systeme mit 96-Well- und 384-Well-Platten ungeeignet sind.

Abstract

Es wird erwartet, dass patientenabgeleitete Tumororganoide (PDOs) ein präklinisches Krebsmodell mit einer besseren Reproduzierbarkeit der Krankheit sind als herkömmliche Zellkulturmodelle. PDOs wurden erfolgreich aus einer Vielzahl von menschlichen Tumoren erzeugt, um die Architektur und Funktion von Tumorgewebe genau und effizient zu rekapitulieren. PDOs sind jedoch für ein In-vitro-Hochdurchsatz-Assay-System (HTS) oder eine Zellanalyse mit 96-Well- oder 384-Well-Platten bei der Bewertung von Krebsmedikamenten ungeeignet, da sie heterogen in der Größe sind und in Kultur große Cluster bilden. Diese Kulturen und Assays verwenden extrazelluläre Matrizen wie Matrigel, um Tumorgewebegerüste herzustellen. Daher haben PDOs einen geringen Durchsatz und hohe Kosten, und es war schwierig, ein geeignetes Assay-System zu entwickeln. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein einfacheres und genaueres HTS unter Verwendung von PDOs zur Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten und Immuntherapien festgelegt. Es wurde ein In-vitro-HTS entwickelt, das PDOs verwendet, die aus soliden Tumoren hergestellt wurden, die in 384-Well-Platten kultiviert wurden. Ein HTS wurde auch zur Beurteilung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitätsaktivität entwickelt, um die Immunantwort unter Verwendung von PDOs darzustellen, die in 96-Well-Platten kultiviert wurden.

Introduction

Menschliche Krebszelllinien sind weithin akzeptiert, um die Biologie von Krebs zu untersuchen und Krebsmittel zu bewerten. Diese Zelllinien bewahren jedoch nicht unbedingt die ursprünglichen Eigenschaften ihres Ausgangsgewebes, da sich ihre Morphologie, Genmutation und ihr Genexpressionsprofil während der Kultur über lange Zeiträume verändern können. Darüber hinaus werden die meisten dieser Zelllinien in einer Monoschicht kultiviert oder als murine Xenotransplantate verwendet, von denen keines physisch Tumorgewebedarstellt 1,2. Daher ist die klinische Wirksamkeit von Krebsmedikamenten möglicherweise nicht die gleiche wie in Krebszelllinien. Daher wurden In-vitro-Systeme wie Ex-vivo-Assays mit patientenabgeleiteten Tumor-Xenotransplantaten oder patientenabgeleiteten Tumororganoiden (PDOs) und Tumorsphäroidmodellen entwickelt, die die Struktur und Funktion von Tumorgewebe genau reproduzieren. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass diese Modelle die Reaktion der Patienten auf Krebsmedikamente vorhersagen, indem sie direkt mit dem entsprechenden Krebsgewebe vergleichbar sind. Diese In-vitro-Systeme wurden für verschiedene Tumorgewebetypen etabliert, und es wurden auch assoziierte Hochdurchsatz-Assay-Systeme (HTS) für das Arzneimittelscreening entwickelt3,4,5,6,7. Heterogene Ex-vivo-Organoidkulturen von Primärtumoren, die aus Patienten oder von Patienten abgeleiteten Tumor-Xenotransplantaten gewonnen wurden, haben in den letzten Jahren aufgrund ihrer einfachen Kultur und ihrer Fähigkeit, die Komplexität von Zellen im Stromagewebe aufrechtzuerhalten, erheblich an Zugkraft gewonnen8,9,10. Es wird erwartet, dass diese Modelle das Verständnis der Biologie von Krebs verbessern und die Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten in vitroerleichtern.

Eine Reihe neuartiger PDOs wurde kürzlich im Rahmen des Fukushima Translational Research Project aus verschiedenen Arten von Tumorgewebe, die als F-PDO bezeichnet werden, entwickelt. Die PDOs bilden große Zellcluster mit einer Morphologie ähnlich der des Quelltumors und können für mehr als sechs Monate kultiviert werden11. Die vergleichende Histologie und umfassende Genexpressionsanalysen zeigten, dass die Merkmale der PDOs auch nach längerem Wachstum unter Kulturbedingungen nahe an denen ihres Ausgangstumorgewebes liegen. Darüber hinaus wurde für jeden Typ von g.U. in 96-Well- und 384-Well-Platten ein geeignetes HTS festgelegt. Diese Assays wurden verwendet, um mehrere molekulare Zielwirkstoffe und Antikörper zu bewerten. Hier wurden Standard-Chemotherapeutika (Paclitaxel und Carboplatin), die bei Endometriumkarzinom eingesetzt werden, mit F-PDOs bewertet, die von einem Patienten abgeleitet wurden, der nicht auf Paclitaxel und Carboplatin ansprach. Dementsprechend war die zellwachstumshemmende Aktivität von Paclitaxel und Carboplatin gegen diese pDO schwach (IC50: >10 μM). Darüber hinaus haben frühere Forschungen berichtet, dass die Empfindlichkeit einiger F-PDOs gegenüber Chemotherapeutika und molekular zielgerichteten Wirkstoffen mit der klinischen Wirksamkeit11,12,13übereinstimmt. Schließlich wurden Veränderungen in der übergeordneten Struktur der PDOs, die durch Krebsmedikamente verursacht wurden, mit einem dreidimensionalen Zellanalysesystem analysiert12,13. Die Ergebnisse der Bewertung von Krebsmedikamenten mit einem pDO-basierten HTS sind vergleichbar mit den klinischen Ergebnissen, die für diese Wirkstoffe erzielt wurden. Hier wird ein Protokoll für ein einfacheres und genaueres HTS vorgestellt, mit dem die Wirksamkeit von Krebsmedikamenten und Immuntherapien anhand der PDO-Modelle bewertet werden kann.

Protocol

Alle Experimente mit Materialien aus menschlichem Anbau wurden im Rahmen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vorab von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Fukushima genehmigt (Zulassungsnummern 1953 und 2192; Zulassungsdaten 18. März 2020 bzw. 26. Mai 2016). Von allen Patienten, die die in dieser Studie verwendeten klinischen Proben zur Verfügung stellten, wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. 1. Kultur der PDOs HINWEIS: F-PDOs bilden Zellcluster, die eine Vielzahl heterogener Morphologien aufweisen und in Suspensionskultur wachsen (Abbildung 1). Darüber hinaus können F-PDOs für mehr als 6 Monate kultiviert und für die zukünftige Verwendung kryokonserviert werden. Auftauen von gespeicherten PDOs (Tag 0) PDOs (z. B. RLUN007, Lungenadenokarzinom) an Tag 0 auftauen und aussäen (Abbildung 1). Geben Sie zunächst 15 ml Medium für PDOs (siehe Materialtabelle),das 1% des B-27-Supplements und 30 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor enthält, in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Nachdem Sie die gefrorene Durchstechflasche aus dem Flüssigstickstofflager entnommen haben, rühren Sie die PDOs vorsichtig in einem 37 °C warmen Wasserbad für 2 min. Als nächstes entfernen Sie die Durchstechflasche aus dem Wasserbad, wischen Sie die Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab und bewegen Sie die Durchstechflasche dann in eine biologische Sicherheitswerkbank. Der Inhalt der Durchstechflasche wird in das Röhrchen mit 15 ml Medium für PDOs überführt. Mischen Sie die PDOs und das Medium, indem Sie fünfmal vorsichtig mit einer 3 ml Transferpipette nach oben und unten pipettieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 x g für 3 min bei ~25 °C und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das DOP-Pellet in 5 ml frischem Medium und geben Sie es mit schonendem Pipettieren in einen25 cm 2-Kolben (siehe Materialtabelle). Schließlich werden die PDOs in einem Inkubator bei 37 °C in 5%CO2 kultiviert. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche (Tage 3-7). Zentrifugieren Sie die DOP-Suspension, um die Zellcluster auszufällen, und ersetzen Sie 4 ml des Mediums (80% Volumen). Resuspendieren Sie die Zellen im frischen Medium.HINWEIS: Die Mehrheit von RLUN007 erscheint als Zellcluster mit einem Durchmesser von 100-500 μm. Wenn sich die Farbe von Phenolrot im Medium wie in Abbildung 1Agezeigt in Gelb ändert, ersetzen Sie das Medium häufiger. Wenn das Medium am Tag nach dem Austausch gelb wird und jeder Zellhaufen zu größeren Clustern mit einem Durchmesser von >500 μm verschmilzt, passieren Sie ihn in einem Teilungsverhältnis von 1: 2. Subkultur (Tage 8-28) von PDOsHINWEIS: Angesichts der Schwierigkeit, die Anzahl der einzelnen Zellen tatsächlich zu messen, wird der Zeitpunkt der Passage auf der Grundlage einer geeigneten Zellclusterdichte und der Größe des DOP-Pellets nach der Zentrifugation bestimmt (Abbildung 1B). Im Falle von RLUN007 erreicht das Volumen des DOP-Pellets etwa 2 Wochen nach dem Auftauen 30 μL (gesättigte Dichte in25 cm 2-Kolben). Für den Transfer von einem 25 cm2-Kolben auf zwei 25 cm2-Flaschen (P1) wird die DOP-Suspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 2 min bei ca. 25 °C mit 200 x g zentrifugiert. Schätzen Sie das Volumen des DOP-Pellets und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das DOP-Pellet mit einer 5-ml-Pipette in 5 ml frischem Medium. Fünfmal bei niedriger Geschwindigkeit vorsichtig auf und ab pipettieren. Anschließend wird die Hälfte des Volumens der DOP-Suspension (2,5 ml) in zwei Kolben gegeben und jedem Kolben 2,5 ml frisches Medium zugegeben. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2. Für den Transfer von zwei 25-cm-2-Kolben auf einen 75-cm-2-Kolben (P2) wird die g.U.-Suspension von zwei Kolben in zweiZentrifugenröhrchen überführt und die gP bei 200 x g für 2 min bei etwa 25 °C zentrifugiert. Als nächstes schätzen Sie das Volumen des DOP-Pellets und resuspenieren Sie das Pellet in 2,5 ml frischem Medium (pro Röhrchen). Anschließend wird die g.U.-Suspension in einem Röhrchen mit der in dem anderen Kolben miteinem Kolben mit 75 cm 2 kombiniert, der 10 ml frisches Medium enthält. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2. Die subkultivierten PDOs etwa 1 Woche nach der ersten Passage von zwei25 cm2 Kolben auf einen 75 cm 2 Kolben übertragen (Abbildung 1C). 2. Wachstumshemmung HTS HINWEIS: Die wachstumshemmende Aktivität von Krebsmedikamenten gegen PDOs wird durch Messung des intrazellulären ATP-Gehalts bewertet, wie in Abbildung 2 dargestellt. Dieser Schritt wird mit einem kommerziell erhältlichen Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit durchgeführt (siehe Materialtabelle). Kulturieren Sie am Tag 0 die PDOs (z. B. RLUN007) in Kolben, bis eine ausreichende Anzahl von Zellclustern für den Assay verfügbar ist. Einen Tag vor der Aussaat die DOP-Suspension von einem 75 cm2-Kolben in ein 15-ml-Röhrchen geben und bei 200 x g für 2 min zentrifugieren, um das GP-Pelletvolumen zu messen. Anschließend das DOP-Pellet in 15 ml frischem Medium resuspendieren und zurück in einen 75 cm2-Kolben geben. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2.HINWEIS: Das erforderliche PDO-Pelletvolumen hängt von der Verdünnungsrate jeder g.U. und der Anzahl der für den Assay verwendeten 384-Well-Platten ab. Für RLUN007 ist ein Zellpelletvolumen von 200 μL für die Aussaat in zehn 384-Well-Platten erforderlich. Am Tag 1 (24 h nach dem Wechsel des Mediums) zerkleinern Sie die PDOs unter Verwendung von Zellfragmentierungs- und Dispersionsgeräten (siehe Materialtabelle)mit einem Filterhalter, der einen 70 μm-Netzfilter enthält. Dann verdünnen Sie 15 ml der DOP-Suspension um das 10-fache. Säen Sie 40 μL der DOP-Suspension in 384-Well-Ultra-Low-Attachment-Sphäroid-Mikroplatten (runder Boden) (siehe Materialtabelle)mit einem Zellsuspensionsspender (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Für das Zerkleinern von Zellclustern wird empfohlen, die handelsübliche Zellfragmentierungs- und Dispersionsausrüstung zu verwenden (siehe Materialtabelle). Nach 24 h nach der Aussaat (Tag 2) werden die PDOs mit 0,04 μL Prüfmittellösungen in Endkonzentrationsbereichen von 20 μM bis 1,0 nM (10 serielle Verdünnungen) mit einem flüssigen Handler behandelt (siehe Materialtabelle). Geben Sie am Tag 8 (144 h nach der Behandlung mit der Prüfsubstanz) intrazelluläres ATP-Messreagenz zu den Prüftöpfen hinzu. Mischen Sie die Platten mit einem Mixer und inkubieren Sie für 10 min bei 25 °C. Messen Sie den intrazellulären ATP-Gehalt als Lumineszenz mit einem Plattenleser (siehe Materialtabelle). Um die Lebensfähigkeit der Zelle zu berechnen, teilen Sie die Menge an ATP in den Testbohrungen durch die Menge in den Kontrollbohrungen, die das Fahrzeug enthalten, wobei der Hintergrund subtrahiert wird. Um die Wachstumsrate über 6 Tage zu berechnen, teilen Sie die Menge an ATP in den Fahrzeugkontrollbohrlöchern durch die in den Fahrzeugkontrollbohrungen 24 h nach der Aussaat. Berechnen Sie die Werte für die 50%ige Hemmkonzentration (IC50)und die Fläche unter der Kurve (AUC) aus den Dosis-Wirkungs-Kurven mit biologischer Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle). Der Z-Faktor ist ein dimensionsloser Parameter, der von 1 (unendliche Trennung) bis <0 reicht, definiert als Z = 1 – (3σc+ + 3σc-) / |μc+ – μc-|, wobei σc+, σc-, μc+ und μc- die Standardabweichungen (σ) und Mittelwerte (μ) der hohen (c+) bzw. niedrigen (c−) Kontrollen14sind. 3. HTS mit einem Cell-Picking- und Imaging-System zur Wachstumshemmung HINWEIS: Wenn es eine große Abweichung (wenn der Variationskoeffizient [CV] beim Assay mehr als 20% in den Daten unter Verwendung von Protokoll 2 gibt, können PDOs einer ausgewählten Größe mit einem Zellpickel- und Bildgebungssystem in 96-Well- oder 384-Well-Platten gesät werden (Abbildung 2). Das Protokoll ist mit dem in den Schritten 2.1 und 2.2 im vorherigen Abschnitt beschriebenen Protokoll identisch. Dieser Schritt wird mit einem handelsüblichen Zellpflück- und Bildgebungssystem durchgeführt (siehe Materialtabelle). Stellen Sie an Tag 1 eine 384-Well-Ultra-Low-Attachment-Sphäroid-Mikroplatte mit 40 μL Medium / Well sowie eine Zielplatte auf dem Zellpickel- und Bildgebungssystem ein. Füllen Sie die Kommissionierkammer (siehe Materialtabelle)mit 6 mL Kulturmedium und zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 2 min, um Luftblasen zu entfernen. Die im Medium suspendierten PDOs (DOP-Pelletvolumen, 4 μL) in die Kommissionierkammer geben und auf die Anlage stellen. Stellen Sie die Kammer für mindestens 1 Minute, gefolgt von der Dispersion, so dass sich die Zellhaufen am Boden der Kammer absetzen; Führen Sie dann ein Scannen der Kammer durch. Stellen Sie die Kommissioniergröße auf 140-160 μm (Fläche 15.386-20.000 μm2)am System zur automatischen Auswahl von Zellclustern ein. Überprüfen Sie anschließend die Qualität der ausgewählten Zellcluster auf den gescannten Bildern und übertragen Sie zehn Zellcluster pro Vertiefung mitHilfe von Kommissionierspitzen (siehe Materialtabelle)in die Zielplatte. Führen Sie die Protokollschritte ab Schritt 2.3 aus. 4. HTS für Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem handelsüblichen System (siehe Materialtabelle)durchgeführt, bei dem es sich um ein elektrisches Impedanzmessgerät handelt. Es wird verwendet, um die Zytolyse von PDOs durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) mit monoklonalen Antikörpern und natürlichen Killerzellen (NK) zu bewerten (Abbildung 3). NK-Zellen werden aus peripheren mononukleären Blutzellen unter Verwendung des NK-Zellproduktionskits (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Messung der ADCC-Aktivität Beschichten Sie am Tag 0 eine 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle)mit 50 μL 10 μg/ml Fibronektinlösung (0,5 μg/Well) bei 4 °C über Nacht. An Tag 1, nachdem die Fibronektinlösung entfernt wurde, fügen Sie 50 μL des Kulturmediums zu jeder Vertiefung hinzu, um die Hintergrundimpedanz zu messen. Vor der Aussaat 5 mL Zellkultur-Dissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle)zu den PDOs (RLUN007: 100 μL des DOP-Pellets in einem 75 cm2-Kolben) geben und in einem CO2-Inkubator bei 37 °C für 20 min inkubieren, um die PDOs zu dispergieren. Um die Trypsinisierung zu stoppen, fügen Sie 5 ml Medium hinzu, zentrifugieren sie und entfernen Sie das Dissoziationsreagenz. Spülen Sie die PDOs mit frischem Medium ab und filtern Sie durch ein 40 μm Zellsieb (siehe Materialtabelle). Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zelllebensfähigkeitsanalysator (siehe Materialtabelle). Übertragen Sie die DOP-Suspension in einen Behälter und mischen Sie sie mit einem Mehrkanalpipettierer. Fügen Sie die DOP-Suspension in Vertiefungen mit 5 x 104 Zellen /Vertiefung in einer 96-Well-Platte hinzu. Jede Vertiefung enthält ein Endvolumen von 100 μL. Anschließend stellen Sie die Platte für 30 min bei ca. 25 °C in eine biologische Sicherheitswerkbank. Die Platte wird ineinem CO2-Inkubator bei 37 °C auf das Gerät übertragen. Zeichnen Sie Änderungen der Impedanzsignale alle 15 Minuten als Zellindex auf. Tauen Sie die NK-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad am selben Tag wie die DOP-Aussaat auf. Die Zellen aus der Durchstechflasche in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml Medium für NK-Zellen (siehe Materialtabelle)überführen und bei 300 x g für 5 min bei ca. 25 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 10 ml frischem Medium. Nach der Zellzählung die Zelldichte auf 1 x 106 Zellen/ml einstellen und in einen 75 cm2 Kolben überführen. Kultivieren Sie die NK-Zellen in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C. Bereiten Sie am Tag 2 die Antikörperlösungen (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) in der 10-fachen Endkonzentration in sterilen V-Bottom-96-Well-Platten vor. Entfernen Sie 60 μL Medium aus jeder Vertiefung und geben Sie 10 μL Trastuzumab- oder Cetuximab-Lösung (10 μg/ml, 1 μg/ml und 0,1 μg/ml) zu den PDOs. Übertragen Sie die Platten in einem Inkubator zurück zum Instrument und zeichnen Sie den Zellindex für 1 h auf. Übertragen Sie die NK-Zellsuspension in ein 50-ml-Röhrchen und zählen Sie die Zellzahl. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und stellen Sie die NK-Zelldichte auf 1 x 106 Zellen/ml und 2 x 106 Zellen/ml mit dem Medium für die PDOs ein. Den Effektorzellen (NK) werden 50 μL NK-Zellsuspension mit einem Zielzellverhältnis (RLUN007) von 1:1 oder 2:1 zugesetzt. Die Endkonzentrationen der Antikörper betragen 1 μg/ml, 0,1 μg/ml und 0,01 μg/ml. Halten Sie die Platte 15 Minuten lang bei ca. 25 °C und bringen Sie die Platten zum Instrument zurück. Datenerhebung und -analyse Konvertieren Sie den Zellindex mit hilfe einer Analysesoftware in prozentuale Zytolysewerte (siehe Materialtabelle). Die prozentuale Zytolyse bezieht sich auf den Prozentsatz der Zielzellen, die von NK-Zellen im Vergleich zu Zielzellen (PDOs) allein als Kontrolle abgetötet werden. Subtrahieren Sie die Zellindizes der Vertiefungen, die nur NK-Zellen enthalten, vom Index der Probenbohrungen zu jedem Zeitpunkt. Normalisieren Sie jeden Wert auf den Zellindex unmittelbar vor der Zugabe von Antikörpern. Konvertieren Sie den normalisierten Zellindex in prozentuale Zytolyse mit der folgenden Gleichung: % Zytolyse = (1 – normalisierter Zellindex [Probentöpfe]) / normalisierter Zellindex (Ziel-Allein-Vertiefungen) x 100.

Representative Results

Ein hochgenaues HTS wurde unter Verwendung von PDOs und 384-Well-Mikroplatten zur Bewertung von Krebsmedikamenten entwickelt, und die Entwicklung eines HTS für jede PDO wurde zuvor berichtet10,11,12,13. Die Leistung des HTS wurde durch berechnung der Lebensläufe und des Z’-Faktors bewertet. Der Z’-Faktor ist eine weithin akzeptierte Methode zur Validierung der Assay-Qualität und -Leistung, und der Assay ist für HTS geeignet, wenn dieser Wert >0,514 beträgt. Die Kontrollbezugspunkte im 384-Well-Plattentest unter Verwendung von RLUN007 zeigten eine geringe Variabilität mit CV-Werten von 5,8% und berechneten Z’-Faktoren von 0,83, wie in Abbildung 4gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Assay eine hohe Leistung für HTS aufweist. Um die Empfindlichkeit von PDOs gegenüber Krebsmedikamenten unter Verwendung von HTS zu untersuchen, wurde die Wachstumshemmung unter Verwendung von RLUN007 untersucht, das mit acht Krebsmedikamenten behandelt wurde, insbesondere epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) -Inhibitoren (Afatinib, Erlotinib, Gefitinib, Lapatinib, Osimertinib und Rociletinib) und Paclitaxel, die klinische Standardbehandlungen für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs sind, und Mitomycin C als Positivkontrolle. Die IC50- und AUC-Werte der Krebsmedikamente für jede g.U. sind in Abbildung 4 dargestellt. Die RLUN007 zeigte eine hohe Sensitivität (IC50 < 2 μM, AUC < 282) für alle EGFR-Inhibitoren und andere Krebsmittel. Sigmoidkurven, die für alle Daten berechnet wurden, zeigten, dass die wachstumshemmende Aktivität der Krebsmedikamente genau gemessen werden konnte. Das Zellpicking- und Bildgebungssystem wird verwendet, wenn die Daten mit der oben genannten Methodik erheblich variieren. Das Zellpicking- und Bildgebungssystem, das Zellcluster genau auswählt, ohne sie zu beschädigen, ermöglicht genaue HTS-Assays, indem es die Zellclustergröße ausrichtet, um Zelltrümmer aus dem Assay-System auszuschließen. Wenn das System nicht verwendet wurde, betrug der CV-Wert 26,0% und der Z’-Faktor-Wert 0,23 (Daten nicht gezeigt). Die CV- und Z’-Faktor-Werte wurden jedoch mit dem System um 6,4% bzw. 0,81 verbessert. Um die Zytolyse von PDOs mit ADCC-Aktivität mit dem elektrischen Impedanzmessgerät zu untersuchen, das die Anzahl, Morphologie und Anheftung von Zellen über einen längeren Zeitraum überwacht, wurden Veränderungen der Impedanzsignale mit RLUN007 bewertet, das mit den Antikörpern (Trastuzumab und Cetuximab) und NK-Zellen als Effektorzellen in einer 96-Well-Platte behandelt wurde. Verglichen mit der Kontrolle, die nur aus Zielzellen bestand, nahm die prozentuale Zytolyse mit der Zeit zu. Es erreichte 45% oder 75% nach 6 h bei einem E:T-Verhältnis von 1:1(Abbildung 5A,C)oder 2:1(Abbildung 5B,D)ohne die Antikörper. Die NK-Zell-vermittelte Zytolyse unter Verwendung von Trastuzumab betrug bei einem Verhältnis von 1:1(Abbildung 5A, 1μg/ml) bzw. 2:1(Abbildung 5B,1 μg/ml) etwa 60 % bzw. 90 % bei 6 h. Im Gegensatz dazu hatte Cetuximab einen dosisabhängigen Einfluss auf die NK-Zell-vermittelte Zytolyse (Abbildung 5C,D). Bei der höchsten Konzentration von Cetuximab wurden RLUN007 zu 90% bzw. 100% in einem Verhältnis von 1:1 bzw. 2:1 zerstört (Abbildung 5C,D). Die Wirkung von Trastuzumab war schwächer als die von Cetuximab, mit nur 60% Zytotoxizität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das PDO-Assay-System die ADCC-Aktivität mit echtzeitbasierter impedanzbasierter Technologie bewerten kann. Abbildung 1: Kritische Punkte für die g.U.-Kultur. (A) Farbänderung im Medium. (B) Messung der Menge an PDOs aus der Pelletgröße durch Auskleidung eines Zentrifugenröhrchens, das die PDOs enthält, mit Röhrchen, die in Konzentrationen für 50-200 μL gekennzeichnet sind. (C) DOP-Dichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Zusammenfassung des Protokolls, das zur Erstellung eines Hochdurchsatz-Assay-Systems mit 384-Well-Mikrotiterplatten verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Zusammenfassung des Protokolls für den Hochdurchsatz-Assay der ADCC-Aktivität. ADCC, Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität; NK, natürlicher Killer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Hochdurchsatz-Assay-System zur Wachstumsinhibierung mit Krebsmedikamenten. Dosis-Wirkungs-Kurve von RLUN007 zu Krebsmedikamenten. Die gehackten PDOs wurden in 384-Well-Platten gesät. Diese wurden 6 Tage lang mit zehn verschiedenen Konzentrationen von Krebsmedikamenten (zwischen 10 μM und 1,5 nM) behandelt. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von dreifachen Experimenten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Hochdurchsatz-Assay für ADCC-Aktivität. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Ein Verhältnis von RLUN007 zu Effektorzellen von 1:1. (B,D) Zytolyse mit einem Verhältnis von RLUN007: Effektorzellen von 1:2. Die Aktivität wurde 12 h nach Zugabe der Effektorzellen gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungsstichproben dargestellt. ADCC, Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Das einzigartige Merkmal von PDOs ist, dass sie während der Kultur oder des Assays nicht enzymatisch in einzelne Zellen getrennt werden und Zellcluster in Kultur erhalten. Daher kann die Anzahl der Zellen unter einem Mikroskop nicht genau gezählt werden. Um dieses Problem zu lösen, wird die Anzahl der Zellen visuell bestimmt, indem ein Zentrifugenröhrchen, das die Zellen enthält, mit Röhrchen ausgekleidet wird, die mit Konzentrationen für 50-200 μL markiert sind (Abbildung 1B). Da es schwierig ist, das Pelletvolumen von Zellclustern, die in einem 25 cm2-Kolben kultiviert wurden, visuell zu messen, wurde der Zeitpunkt der Passage anhand der mittleren Farbänderung von Rot nach Gelb und der spürbaren Zunahme einzelner Zellen oder Trümmer im Vergleich zur Zeit des Passierens als Indikatoren bestimmt (Abbildung 1A,C). Dies ist der Punkt des Passagings für PDOs. Die Menge der g.U.-Pellets wird nach der Zentrifugation bei jedem Mediumwechsel visuell gemessen. Wenn das Pelletvolumen aufhört zuzunehmen und das Medium am Tag nach dem Mediumaustausch gelb wird, gilt das Medium als mit Dichte gesättigt und es wird eine Passage durchgeführt. Das Pelletvolumen wird für jede g.U. definiert. Wenn sich die PDOs nicht vermehren, wird die Menge des Mediums zum Zeitpunkt des Medienaustauschs von 80% auf 50% geändert und die Dichte der PDOs wird in der Kultur erhöht.

Ein für PDOs geeignetes HTS wurde entwickelt. Sein Durchsatz beträgt mindestens zehn bis zwanzig 384-Well-Platten, die mit einem 75 cm2-Kolben g.U. durchgeführt werden, und die Anzahl der pro Tag verarbeiteten Platten beträgt mindestens 50. Darüber hinaus wurden bereits die Ergebnisse der Bewertung verschiedener Krebsmedikamente durch HTS unter Verwendung von PDOs berichtet.

Bei der Durchführung von HTS wird die Verstopfung des Netzfilters, die durch das Zerkleinern der F-PDOs unter Verwendung der Zellfragmentierungs- und Dispergierausrüstung verursacht wird, zunächst durch Ändern der Maschenweite des Filters auf 100 μm behoben. Der nächste Schritt besteht darin, das Volumen der auf das Glasgefäß aufgetragenen DOP-Suspension zu reduzieren. Bei der Herstellung von Prüfsubstanzlösungen für HTS werden niedermolekulare Verbindungen üblicherweise in Dimethylsulfoxid gelöst, und die Antikörper werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst. Als Prüfsubstanz wird das geeignete Lösungsmittel verwendet, und die Kontrolldaten werden aus dem verwendeten Lösungsmittel gewonnen.

Im Folgenden finden Sie eine Beschreibung des Umgangs mit der Variabilität der Assay-Daten. Wenn die Daten im Test mit 384-Well-Platten große Abweichungen aufweisen, sollte die Assay-Platte in ein 96-Well-Plattenformat geändert werden. Der PDO-Verdünnungsfaktor (Anzahl der ausgesäten Zellcluster) wird ebenfalls nach der Aussaat der Platte untersucht. Schließlich kann das Zellpicking- und Bildgebungssystem verwendet werden, um die Größe der PDOs für den Assay auszuwählen. Vor dem Hinzufügen von PDOs zur Kammer sollten einzelne Zellen und kleine Zellcluster durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit entfernt werden, um PDOs korrekt erkennen zu können. Wenn einzelne Zellen oder kleine Zellcluster nach dem Hinzufügen von PDOs zur Kammer sichtbar sind, können mehrere Dispersionen durchgeführt werden, um die einzelnen Zellen zu entfernen. Obwohl das Cell-Picking- und Imaging-System über eine Funktion verfügt, mit der die Platte warm gehalten werden kann, wird diese Funktion aufgrund der Verdunstung des Kulturmediums nicht verwendet, wenn das System über einen längeren Zeitraum arbeitet. Schließlich ist das Volumen von Zellclustern unbekannt, da es von einem planaren Bild erkannt wird. Wenn sich außerdem zwei oder mehr PDOs überschneiden, kann eine einzelne PDO nicht korrekt erkannt werden. Es ist jedoch möglich, unerwünschte PDOs mit der Entfernungsfunktion zu entfernen, indem Sie sie nach dem Verschieben auf dem gescannten Bild überprüfen.

Das elektrische Impedanzmessgerät wird im Allgemeinen für adhärente Zielkrebszellen verwendet, um Änderungen der Impedanz während der Zellproliferation zu überwachen. Daher wird eine Veränderung des Zellindex von nicht adhärenten PDOs nicht erkannt. Um dieses Problem zu lösen, ist es notwendig, die Seeding-Bedingungen wie PDO-Dichte und enzymatische Behandlung (Zelldissoziationsenzym und Behandlungszeit) in Abhängigkeit von der Art der PDO zu untersuchen. Die Vertiefungen in der Platte müssen auch mit einer geeigneten extrazellulären Matrix für die Aussaat von PDOs beschichtet werden. PDOs werden ohne enzymatische Behandlung ausgesät, abhängig von der Art der PDO. RLUN007 wurde verwendet, um die Impedanz zu messen, indem die PDOs auf einer 96-Well-Platte ausgesät wurden, nachdem sie durch enzymatische Behandlung dispergiert wurden. RLUN007 wurde mit dem Zellkultur-Dissoziationsreagenz für 20 min bei 37 °C behandelt, um die Zellen zu dispergieren und an die Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu binden. Da dissoziierte RLUN007-Zellen sofort Aggregate bilden, ist es wünschenswert, direkt nach der Filtration mit einem Sieb auf den Platten zu säen. Nach dem Übertragen der Zellsuspension aus dem Rohr in ein Reservoir wurde das Reservoir zwei- bis dreimal vorsichtig von rechts nach links bewegt und fünfmal auf und ab pipettiert, bevor es auf die Platte gesät wurde. Die Aufhängung wurde ebenfalls mit jedem Zusatz zum Brunnen gemischt. Die Platte wurde dann für 30 min (für PDOs) bzw. 15 min (für NK-Zellen) in eine biologische Sicherheitswerkbank gelegt, damit sich die Zellen gleichmäßig im Brunnen verteilen können. Der zweite wichtige Punkt ist, dass die Behandlung mit Antikörpern und NK-Zellen zeitlich festgelegt werden sollte, bevor der Zellindex ein Plateau erreicht und der Wert nicht weniger als 0,5 beträgt. Im Fall von RLUN007 ist der optimale Zeitpunkt für den Beginn des Assays 20-22 h nach der Beschichtung und die Zellzahl für die Aussaat beträgt 5 x 104 Zellen / Well.

Im Allgemeinen verwenden die Kultur und Assays für Tumororganoide extrazelluläre Matrizen wie Matrigel, um Tumorgewebegerüste oder Enzyme wie Trypsin und Kollagenase zu erzeugen, um die Organoide3,4 ,5,6,7zu stören . Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass während der Kultur und des Assays keine extrazelluläre Matrix oder enzymatische Behandlung erforderlich ist (mit Ausnahme von Assays mit dem elektrischen Impedanzmessgerät), was den Arbeitsaufwand und die Kosten erheblich reduziert. Darüber hinaus lässt sich diese Methode relativ einfach an HTS-Assay-Systeme und verschiedene Messsysteme anpassen. Die Verwendung einer extrazellulären Matrix ist jedoch für einige Forschungszwecke wünschenswert, da sie als Gerüst für Zellen dienen und die Morphogenese, Differenzierung und Homöostase in Geweben beeinflussen kann.

In dieser Studie wurden PDOs (RLUN007) mit einer EGFR-Mutation (L858R), die klinisch empfindlich auf EGFR-Inhibitoren ist, und hoher Expression des EGFR-Gens (Daten nicht gezeigt) zur Bewertung von EGFR-Inhibitoren verwendet. Es wurde gezeigt, dass die Sensitivität von RLUN007 gegenüber EGFR-Inhibitoren höher war als die anderer aus Lungenkrebs abgeleiteter F-PDOs13 (Abbildung 4). Somit ist ein HTS mit PDOs, die die Eigenschaften des Tumorgewebes beibehalten, für die Bewertung potenzieller Krebsmedikamente überlegen und bietet Möglichkeiten zur Arzneimittelbewertung und Fortschritte in der personalisierten Medizin. Obwohl HTS für das anfängliche Screening von Wirkstoffen geeignet ist, reproduziert es nicht die Tumormikroumgebung und kann daher die Wirksamkeit von Arzneimitteln in vivonicht bewerten. Daher wird derzeit ein In-vitro-System entwickelt, das menschliches Tumorgewebe in vivo durch Kokultur mit vaskulären Endothelzellen und anderen Stromazellen oder Organ-on-a-Chip-Technologie in Abwesenheit von Tiermodellen nachahmen kann.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten uns bei den Patienten bedanken, die die in dieser Forschung verwendeten klinischen Proben zur Verfügung gestellt haben. Diese Forschung wird durch Zuschüsse des Translational Research Program der Präfektur Fukushima unterstützt.

Materials

384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate Corning 4516 Plates for HTS
40-µm Cell Strainer Corning 352340
AdoptCell-NK kit Kohjin Bio 16030400 Kit for NK cell production
Cancer Cell Expansion Media plus Fujifilm Wako Pure Chemical 032-25745 Medium for F-PDO
ALyS505N-175 Cell Science & Technology institute 10217P10 Medium for NK cells
CELL HANDLER Yamaha Motor – Cell picking and imaging system
CellPet FT JTEC – Cell fragmentation and dispersion equipment
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9683 Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent
Echo 555 Labcyte – Liquid handler
EnSpire PerkinElmer – Plate reader
E-plate VIEW 96 Agilent 300601020 Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System
Fibronectin Solution Fujifilm Wako Pure Chemical 063-05591 Plate coating for xCELLigence RTCA System
F-PDO Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International – The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International
Morphit software, version 6.0 The Edge Software Consultancy Biological data analysis software
Multidrop Combi ThermoFisher Scientific 5840300 Cell suspension dispenser
Precision Chamber Yamaha Motor JLE9M65W230 Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER
Precision Tip Yamaha Motor JLE9M65W300 Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER
RLUN007 Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International Lung tumor derived F-PDO
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604021 Cell culture dissociation reagent
Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask Corning 4616 Culture flask for PDO
Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask Corning 3814 Culture flask for PDO
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System Beckman coulter – Cell viability analyzer
xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 ACEA Bioscience – Analysis software for xCELLigence RTCA System
xCELLigence RTCA System ACEA Bioscience – Electrical impedance measuring instrument for cytolysis
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Riferimenti

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Patient-derived Tumor OrganoidsHigh-throughput In Vitro AssayCell Analysis2D Culture3D CultureMolecular Targeted DrugsCell Suspension384-well MicroplateLiquid HandlerCell Fragmentation And Dispersion Instrument

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Citazione di questo articolo
Higa, A., Takahashi, N., Hiyama, G., Tamura, H., Hoshi, H., Shimomura, K., Watanabe, S., Takagi, M. High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids. J. Vis. Exp. (172), e62668, doi:10.3791/62668 (2021).
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