Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).
Abstract
Les fonctions potentielles des cellules de type hépatocytes (CHN) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont très prometteuses pour les applications de modélisation des maladies et de dépistage des médicaments. Il est fourni ici une méthode efficace et reproductible pour différencier les CSEh en CSH fonctionnels. L’établissement d’une lignée endodermique est une étape clé dans la différenciation aux HLCs. Par notre méthode, nous régulons les voies de signalisation clés en complétant continuellement l’Activine A et le CHIR99021 lors de la différenciation hESC en endoderme définitif (DE), suivie de la génération de cellules progénitrices hépatiques, et enfin des CHN avec une morphologie hépatocytes typique dans une méthode par étapes avec des réactifs complètement définis. Les HNC dérivés du hESC produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques au stade (y compris l’albumine, le récepteur nucléaire HNF4α et le polypeptide de cotransport du taurocholate de sodium (NTCP)), et présentent des caractéristiques particulières liées aux hépatocytes matures et fonctionnels (y compris la coloration verte à l’indocyanine, le stockage du glycogène, la coloration à l’hématoxyline-éosine et l’activité CYP3), et peuvent fournir une plate-forme pour le développement d’applications à base de HLC dans l’étude des maladies du foie.
Introduction
Le foie est un organe hautement métabolique qui joue plusieurs rôles, notamment la désoxydation, le stockage du glycogène, la sécrétion et la synthèse des protéines1. Divers agents pathogènes, médicaments et hérédité peuvent provoquer des changements pathologiques dans le foie et affecter ses fonctions2,3. Les hépatocytes, en tant que principale unité fonctionnelle du foie, jouent un rôle important dans les systèmes artificiels de soutien du foie et l’élimination de la toxicité des médicaments. Cependant, la ressource en hépatocytes humains primaires est limitée dans la thérapie cellulaire, ainsi que dans la recherche sur les maladies du foie. Par conséquent, le développement de nouvelles sources d’hépatocytes humains fonctionnels est une direction de recherche importante dans le domaine de la médecine régénérative. Depuis 1998, date à laquelle les CSEh ont étéétablies, 4, les CSEh ont été largement prises en compte par les chercheurs en raison de leur potentiel de différenciation supérieur (ils peuvent se différencier en divers tissus dans un environnement approprié) et de leur haut degré d’autorenouvrabilité, et fournissent ainsi des cellules sources idéales pour les foies bioartificiels, la transplantation d’hépatocytes et même l’ingénierie tissulaire hépatique5.
Actuellement, l’efficacité de la différenciation hépatique peut être considérablement augmentée en enrichissant l’endoderme6. Dans la différenciation de la lignée des cellules souches en endoderme, les niveaux de la signalisation du facteur de croissance transformant β (TGF-β) et des voies de signalisation WNT sont les facteurs clés dans le nœud de l’étape de formation de l’endoderme. L’activation d’un haut niveau de signalisation TGF-β et WNT peut favoriser le développement de l’endoderme7,8. L’activine A est une cytokine appartenant à la superfamille TGF-β. Par conséquent, l’activine A est largement utilisée dans l’induction endodermique de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) et decsh 9,10. GSK3 est une protéine kinase sérine-thréonine. Les chercheurs ont constaté que CHIR99021, un inhibiteur spécifique de GSK3β, peut stimuler les signaux WNT typiques, et peut promouvoir la différenciation des cellules souches dans certaines conditions, ce qui suggère que CHIR99021 a le potentiel d’induire la différenciation des cellules souches dans l’endoderme 11,12,13.
Ici nous rapportons une méthode efficace et reproductible pour induire efficacement la différenciation des cseh en HLCs fonctionnels. L’addition séquentielle de l’Activine A et du CHIR99021 a produit environ 89,7±0,8 % de cellules SOX17 (marqueur DE) positives. Après avoir été encore maturées in vitro,ces cellules ont exprimé des marqueurs spécifiques hépatiques et exercé hépatocytes-comme la morphologie (basée sur la souillure d’hématoxyline-éosine (H &E)) et les fonctions, telles que l’absorption du vert d’indocyanine (ICG), le stockage de glycogène et l’activité CYP3. Les résultats montrent que les CSEh peuvent être différenciés avec succès en CSH fonctionnels matures par cette méthode et peuvent fournir une base pour la recherche liée aux maladies du foie et le dépistage in vitro des médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons une méthode par étapes qui induit des CHN à partir de CSEh en trois étapes. Dans la première étape, Activin A et CHIR99021 ont été utilisés pour différencier les CSEh en DE. Dans la deuxième étape, KO-DMEM et DMSO ont été utilisés pour différencier DE en cellules progénitrices hépatiques. Au cours de la troisième étape, le HZM plus HGF, l’OSM et le sel de sodium de l’hydrocortisone 21-hemisuccinate ont été utilisés pour continuer à différencier les cellules progénitrice…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (n° 81571994 à P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
Riferimenti
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