השתלת צינורית ישירה ב"ציסטרנה מגנה של חזירים"
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב להשתלת צינורית ישירה בבור החזירים.
Abstract
מערכת גלימפטית היא מערכת פינוי פסולת במוח הנשענת על זרימת נוזל השדרתי (CSF) בחללי כלי דם הקשורים לאסטרוציטים, והיא הייתה מעורבת בסיווג של פפטידים נוירוטוקסיים כגון עמילואיד-בטא. תפקוד גלימפטי לקוי מחריף את הפתולוגיה של המחלה במודלים של בעלי חיים של מחלות ניווניות, כגון אלצהיימר, המדגיש את החשיבות של הבנת מערכת סיווג זו. מערכת גלימפטית נחקרת לעתים קרובות על ידי cannulations מגנה בור (CMc), שבו מעקבים מועברים ישירות לתוך הנוזל השדרתי (CSF). עם זאת, רוב המחקרים בוצעו במכרסמים. כאן, אנו מדגימים הסתגלות של טכניקת CMC בחזירים. באמצעות CMc בחזירים, ניתן ללמוד את המערכת הגלימפטית ברזולוציה אופטית גבוהה במוחות גיראנצפליים ובכך מגשרת על פער הידע בין מכרסמים לגלימפטיקה אנושית.
Introduction
נוזל השדרתי (CSF) הוא אולטרה סינון של דם אשר נמצא בתוך ומסביב למערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2. מלבד מתן ציפה למוח או ספיגת כוחות מכניים מזיקים, CSF ממלא גם תפקיד מרכזי בניקוי פסולת מטבולית מה- CNS3. פינוי פסולת מתאפשר על ידי מערכת גלימפטית שאופיינה לאחרונה המאפשרת את זרימת הקונבקטיבית של CSF דרך פרנצ’ימה במוח דרך מרחבים perivascular (PVS), אשר סובבים עורקים חודרים3,4,5. תהליך זה הוכח כתלוי במים-4 (AQP4), תעלת מים המתבטאת בעיקר בקצה האסטרוציטי, הקשור ל- PVS4,6. המחקר של המערכת הגלימפטית מושגת הן על ידי דימות ויוו והן על ידי ex vivo, באמצעות מיקרוסקופיה אור מתקדמת או הדמיית תהודה מגנטית (MRI), לאחר כניסתו של מעקב פלואורסצנטי / רדיואקטיבי או סוכן ניגוד לתוך CSF7,8,9,10,11.
דרך יעילה להכניס מכשיר מעקב לתוך CSF מבלי לגרום נזק לפרנצ’ימה במוח היא באמצעות קנוניציה מגנה בור (CMc)12,13. רוב גדול של כל המחקרים הגלימפטיים, עד כה בוצעו במכרסמים ונמנעו ביונקים גבוהים יותר בגלל הפולשניות של CMc בשילוב עם הפשטות המעשית של עבודה עם יונק קטן. בנוסף, גולגולות דקות של עכברים מאפשרות הדמיית ויוו ללא צורך בחלון גולגולת ולאחר מכן מאפשרות חילוץ מוח לא מסובך11,14. ניסויים שבוצעו בבני אדם הניבו נתונים מקרוסקופיים בעלי ערך ב-vivo על הפונקציה הגלימפטית, אך הסתמכו על זריקות מעקב תוך-אט-תיא-צילומי בעמוד השדרה המותני הדיסטלי, יתר על כן, משתמשים ב-MRI שאינו מניב רזולוציה מספקת כדי ללכוד את המיקרואנטומיה של המערכת הגלימפטית7,15,16 . הבנת הארכיטקטורה והיקף המערכת הגלימפטית ביונקים גבוהים יותר חיונית לתרגומה לבני אדם. על מנת להקל על תרגום גלימפטי לבני אדם, חשוב ליישם טכניקות המתבצעות במכרסמים ליונקים גבוהים יותר כדי לאפשר השוואות ישירות של המערכת הגלימפטית על פני מינים של קוגניציה גוברת ומורכבות המוח17. מוחות חזירים ואנושיים הם gyrencephalic, בעל נוירו-ארכיקטורה מקופלת, בעוד מוחות מכרסמים הם lissencephalic, ובכך יש הבדל משמעותי בין אחד לשני. במונחים של הגודל הכולל, מוחות חזירים דומים יותר לבני אדם, קטנים פי 10-15 מהמוח האנושי, בעוד מוחות העכבר קטנים פי 3,000 מ-18. על ידי הבנה טובה יותר של המערכת הגלימפטית ביונקים גדולים, ייתכן שניתן יהיה לנצל את המערכת הגלימפטית האנושית להתערבות טיפולית עתידית בתנאים כגון שבץ מוחי, פגיעה מוחית טראומטית ונוירו-דגנרציה. CMc ישיר בחזירים ב vivo היא שיטה המאפשרת מיקרוסקופיית אור ברזולוציה גבוהה של מערכת גלימפטית ביונק גבוה יותר. יתר על כן, בשל גודל החזירים המשמשים, ניתן ליישם מערכות ניטור דומות לאלה המשמשות בניתוחים אנושיים מה שהופך אותו אפשרי לתעד ולווסת פונקציות חיוניות כדי להעריך כיצד אלה תורמים לתפקוד הגלימפטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
להלן, מתואר, פרוטוקול מפורט לביצוע השיעון הישיר של בור הים בחזירים, כולל ההכנה הדרושה, הליך כירורגי, עירוי מעקב ומיצוי המוח. זה דורש מישהו עם ניסיון והסמכה לעבודה עם בעלי חיים גדולים. אם מתבצע כראוי, זה מאפשר משלוח של מולקולות הרצויות עם בטחון ישירות לתוך CSF, ולאחר מכן סדרה של שיטות הדמיה אור …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן קנוט ואליס ולנברג, Hjärnfonden, קרנות וונר גרן וקרן קרפורד.
Materials
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
Riferimenti
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M. Garbage truck of the brain. Science. 340 (6140), 1529-1530 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic function in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2021).
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D’Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
