İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi
Summary
Bu çalışma, embriyo biyopsisini önleyen ve NGS kullanılarak kromozom ploidi tanımlamasını sağlayan, harcanan kültür ortamını kullanan insan embriyolarının kromozom taraması için bir protokol bildirmektedir. Bu makale, kültür ortamının hazırlanması, tüm genom amplifikasyonu (WGA), yeni nesil dizileme (NGS) kütüphanesinin hazırlanması ve veri analizi dahil olmak üzere ayrıntılı prosedürü sunmaktadır.
Abstract
Klinik in vitro fertilizasyonda (IVF), PGT-A için geçerli yöntem, trofektodermden (TE) birkaç hücrenin biyopsisini gerektirir. Bu, plasentayı oluşturan soydur. Bununla birlikte, bu yöntem özel beceriler gerektirir, invazivdir ve yanlış pozitiflerden ve negatiflerden muzdariptir, çünkü TE’deki kromozom sayıları ve fetüse dönüşen iç hücre kütlesi (ICM) her zaman aynı değildir. Hem TE hem de ICM’den kültür ortamına salınan DNA’nın dizilenmesini gerektiren bir teknoloji olan NICS, bu sorunlara bir çıkış yolu sunabilir, ancak daha önce sınırlı etkinliğe sahip olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma, kültür ortamı örnekleme yöntemlerini, tüm genom amplifikasyonunu (WGA) ve kütüphane hazırlığını ve analiz yazılımı ile NGS veri analizini içeren NICS’nin tam protokolünü bildirmektedir. Farklı embriyo laboratuvarlarındaki farklı kriyoprezervasyon süreleri göz önüne alındığında, embriyologların IVF laboratuvarının gerçek koşullarına göre seçilebilecek embriyo kültürü ortamını toplamak için iki yöntemi vardır.
Introduction
Yardımcı üreme teknolojileri (ART’ler) infertilite tedavisinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, IVF gibi ART’nin başarı oranı sınırlı kalmıştır ve gebelik kaybı oranı normal popülasyondan önemli ölçüde daha yüksektir1. Bu sorunların ana nedeni, preimplantasyon insan embriyolarında yaygın olarak bulunan kromozomal anormalliklerdir2. PGT-A, implantasyondan önce embriyoları kromozomal denge açısından taramak için etkili bir yöntemdir 3,4. Bazı çalışmalar PGT-A’nın düşük oranını azaltabileceğini ve gebelik oranını artırabileceğini kanıtlamıştır 5,6,7,8. Bununla birlikte, PGT-A, özel eğitim ve deneyim gerektiren karmaşık teknik uzmanlık gerektirir. İnvaziv embriyo biyopsisi prosedürü de potansiyel olarak embriyolara zarar verebilir9. Çalışmalar, blastomer biyopsisinin sonraki gelişimi engelleyebileceğini ve biyopsi yapılan TE’lerin sayısının implantasyon oranlarını etkileyebileceğini göstermiştir10. Embriyo biyopsisinin uzun dönem biyogüvenlik konusu insanlarda henüz tam olarak değerlendirilmemiş olsa da, hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar embriyo gelişimi üzerindeki olumsuz etkilerini göstermiştir11,12,13.
Önceki raporlar, embriyo gelişimi sırasında kültür ortamına eser miktarda DNA materyali salgılandığını ve kullanılmış embriyo kültür ortamı 14,15,16,17,18 kullanılarak kapsamlı kromozom taraması (CCS) yapmak için çaba gösterildiğini göstermiştir. Bununla birlikte, tespit oranları ve testlerin doğruluğu, kapsamlı klinik kullanım gereksinimlerini karşılamamıştır. Bu çalışma, NICS testinin doğruluğunun yanı sıra tespit oranlarını artırmak için NICS testinde bir iyileşme olduğunu bildirmiştir19. Son yıllarda, blastokoele sıvısı (BF), minimal invaziv PGT-A’nın analitik bir örneği olarak incelenmiştir. Bununla birlikte, blastosist sıvısı örneklerinde başarılı genom çapında amplifikasyon ve saptanabilir DNA oranı %34,8 ile %82 arasında değişmektedir20,21,22. Çeşitli çalışmalarda bildirilen BF hacmi 0.3 nL ila 1 μL arasında değişmektedir. BF’deki düşük DNA miktarı göz önüne alındığında, tespitin başarı oranını ve tutarlılığını artırmak için blastosist sıvısı ve kültür ortamını karıştırarak hücresiz DNA miktarını artırmak mümkündür. Kuznyetsov ve ark.23 ve Li ve ark.24, zona pellucida’yı bir lazerle tedavi etti ve toplam embriyonik DNA miktarını iyileştirmek için blastosist sıvısını kültür ortamına saldı ve WGA’dan sonra kombine ortam/BF örneklerinin amplifikasyon oranı sırasıyla %100 ve %97.5 idi. Jiao ve ark.25 de aynı yöntemi kullanarak %100 amplifikasyon başarı oranı elde etmiştir.
Bu çalışma, harcanan ortam örneği hazırlama, NGS hazırlama ve veri analizini içeren ayrıntılı bir protokol bildirmektedir. Bu çalışmada oositlerden kümülüs hücreleri dikkatlice çıkarılarak intrasitoplazmik tek sperm enjeksiyonu (ICSI) ve blastosist kültürü uygulandı. 4. gün 5/6. gün WGA ve NGS kütüphane hazırlığı için orta toplandı. Bu çalışmada NICS teknolojisi kullanılarak WGA ve NGS kütüphanesi hazırlama adımları yaklaşık 3 saatte kolaylaştırılmış ve CCS sonuçları yaklaşık 9 saat içinde noninvaziv olarak elde edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Değişiklikler ve sorun giderme
NICS sonuçları ebeveyn genetik materyalleri ile kontamine olmuşsa, tüm kümülüs-korona radiata hücrelerinin çıkarıldığından emin olun ve döllenme için ICSI yapıldığından emin olun. DNA’yı bozabilecek uygun olmayan ortam depolama veya şablon hazırlama işlemlerinden kaçınılır. Çalışma alanı DNase ve RNase dekontaminasyon reaktifleri ile iyice saflaştırıldı. Diğer embriyolardan kontaminasyonu önlemek için, 4. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, NGS veri analizindeki yardımları için Shiping Bo ve Shujie Ma’ya teşekkür eder. Finansman: Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Hibe No. 2018YFC1003100) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
Riferimenti
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
- Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
- Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
- Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
- Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
- Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
- Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
- Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
- Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
- Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
- Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
- Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
- Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
- Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicina. 94 (12), e669 (2015).
- Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
- Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
- Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?. Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
- Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
- Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
- Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
- Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter’s syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
- Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
- . Qubit dsDNA HS Assay Kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015)
- . Miseq system use guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system (2016)
- Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
- Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
- Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
- Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
- Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).
