Хромосомный скрининг преимплантационных эмбрионов человека с использованием отработанной питательной среды: забор образцов и анализ хромосомной плоидности
Summary
В настоящем исследовании представлен протокол хромосомного скрининга эмбрионов человека, использующий отработанную питательную среду, что позволяет избежать биопсии эмбриона и позволяет идентифицировать хромосомную плоидию с помощью NGS. В настоящей статье подробно описана процедура, включающая подготовку питательной среды, полногеномную амплификацию (WGA), подготовку библиотеки секвенирования нового поколения (NGS) и анализ данных.
Abstract
При клиническом экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) преобладающий метод ПГТ-А требует биопсии нескольких клеток трофэктодермы (ТЭ). Это линия, которая формирует плаценту. Этот метод, однако, требует специальных навыков, является инвазивным и страдает от ложноположительных и отрицательных результатов, потому что число хромосом в ТЭ и внутренняя клеточная масса (ВКМ), которая развивается в плод, не всегда совпадают. NICS, технология, требующая секвенирования ДНК, которая высвобождается в питательную среду как из TE, так и из ICM, может предложить выход из этих проблем, но ранее было показано, что она имеет ограниченную эффективность. В настоящем исследовании представлен полный протокол NICS, который включает в себя методы отбора проб питательных сред, полногеномную амплификацию (WGA) и подготовку библиотеки, а также анализ данных NGS с помощью аналитического программного обеспечения. Учитывая разное время криоконсервации в разных лабораториях эмбрионов, у эмбриологов есть два метода сбора питательной среды для эмбрионов, которые могут быть выбраны в соответствии с фактическими условиями лаборатории ЭКО.
Introduction
Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) все чаще используются для лечения бесплодия. Тем не менее, показатели успешности ВРТ, таких как ЭКО, были ограничены, а частота потери беременности значительно выше, чем в нормальной популяции1. Основной причиной этих проблем являются хромосомные аномалии, которые обычно встречаются у преимплантационных эмбрионов человека2. ПГТ-А является эффективным методом скрининга эмбрионов на хромосомный баланс перед имплантацией 3,4. Некоторые исследования доказали, что ПГТ-А может снизить частоту абортов и улучшить частоту наступления беременности 5,6,7,8. Тем не менее, PGT-A требует сложных технических знаний, которые требуют специальной подготовки и опыта. Инвазивная процедура биопсии эмбриона также потенциально может привести к повреждению эмбрионов9. Исследования показали, что биопсия бластомеров может препятствовать последующему развитию, а количество биопсированных ТЭ может влиять на частоту имплантации10. Несмотря на то, что долгосрочная проблема биобезопасности биопсии эмбриона еще не была тщательно оценена на людях, исследования на животных показали ее негативное влияние на развитие эмбриона11,12,13.
В предыдущих сообщениях указывалось, что следовые количества материалов ДНК секретировались в питательной среде во время развития эмбриона, и были предприняты усилия по проведению комплексного хромосомного скрининга (CCS) с использованием отработанной питательной средыэмбрионов 14,15,16,17,18. Тем не менее, частота выявления и точность тестов не соответствовали требованиям для широкого клинического использования. В настоящем исследовании сообщалось об улучшении анализа NICS для повышения частоты обнаружения, а также точности теста NICS19. В последние годы бластоцельная жидкость (БФ) изучается в качестве аналитического образца малоинвазивной ПГТ-А. Однако доля успешной полногеномной амплификации и детектируемой ДНК в образцах жидкости бластоцисты колеблется от 34,8% до 82%20,21,22. Объем БФ, о котором сообщалось в различных исследованиях, колеблется от 0,3 нл до 1 мкл. Учитывая низкое количество ДНК в БФ, можно увеличить количество внеклеточной ДНК путем смешивания бластоцистной жидкости и питательной среды для улучшения успешности и последовательности обнаружения. Кузнецов и др.23 и Li et al.24 обрабатывали zona pellucida лазером и выпускали бластоцистную жидкость в питательную среду для улучшения общего количества эмбриональной ДНК, а скорость амплификации комбинированных образцов среды/БФ после WGA составила 100% и 97,5% соответственно. Jiao et al.25 также получили 100% успешность амплификации, используя тот же метод.
В настоящем исследовании представлен подробный протокол, включающий подготовку проб отработанных сред, подготовку NGS и анализ данных. Путем тщательного удаления кумулюсных клеток из ооцитов, в настоящем исследовании была проведена интрацитоплазматическая инъекция одного сперматозоида (ИКСИ) и культивирование бластоцисты. Для подготовки библиотек WGA и NGS был собран материал 4-го дня 5-го дня и 6-го дня. Используя технологию NICS, настоящее исследование оптимизировало этапы подготовки библиотек WGA и NGS примерно за 3 ч и получило результаты CCS неинвазивным способом примерно за 9 ч.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модификации и устранение неполадок
Если результаты NICS загрязнены родительским генетическим материалом, убедитесь, что все лучевые клетки кучевой короны удалены, и убедитесь, что для оплодотворения проводится ИКСИ. Это позволяет избежать неправильного хранени…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Шипин Бо (Shiping Bo) и Шуцзе Ма (Shujie Ma) за помощь в анализе данных NGS. Финансирование: работа выполнена при поддержке Национальной программы ключевых исследований и разработок (грант No 2018YFC1003100).
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
Riferimenti
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
- Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
- Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
- Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
- Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
- Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
- Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
- Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
- Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
- Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
- Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
- Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
- Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
- Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicina. 94 (12), e669 (2015).
- Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
- Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
- Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?. Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
- Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
- Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
- Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
- Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter’s syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
- Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
- . Qubit dsDNA HS Assay Kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015)
- . Miseq system use guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system (2016)
- Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
- Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
- Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
- Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
- Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).
