Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR
Summary
Bu protokol, gRNA kaynaklı Cas9 bölünmesi ve DNA onarımının ardından hedef sahalarda homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) olaylarının tanımlanması ve nicelleştirilmesi için analiz de dahil olmak üzere DNA ekstraksiyonundan dijital damlacık PCR (ddPCR) için deneysel kuruluma kadar adımları sağlar. Bu yöntemin diğer kullanımları arasında polimorfizm tespiti ve gen düzenleme varyant doğrulaması gibi uygulamalar yer almaktadır.
Abstract
Sivrisinek genomik ve genetik mühendisliği teknolojilerindeki son gelişmeler, hedeflenen DNA dizi varyasyonlarını büyük ölçekte tespit etmek için hızlı ve verimli yöntemlere duyulan ihtiyacı teşvik etti. Özellikle, CRISPR kılavuzu RNA (gRNA)/Cas9 aracılı homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) tarafından oluşturulan gen düzenlemeli sitelerdeki eklemelerin ve silmelerin (indels) tespiti, mutajeninzin doğruluğunu ve istenmeyen değişikliklerin sıklığını değerlendirmek için önemlidir. Burada, yüksek verimli NHEJ analizi için çok uygun olan dijital damlacık PCR (ddPCR) için bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem, tek tek sıra varyasyonlarını tanımlayan veriler üretmese de, bir popülasyon içindeki sıra varyasyonunun nicel bir tahminini sağlar. Ayrıca, uygun kaynaklarla, bu protokol bir alan alanı laboratuvar ortamında yeni nesil veya Sanger diziliminden daha kolay uygulanabilir. ddPCR ayrıca, genetik olarak tasarlanmış organizmaların saha denemeleri sırasında vahşi popülasyonlardaki genetik varyasyonun daha hızlı ve eksiksiz bir analizini sağlayan bu yöntemlerin her ikisinden de daha hızlı bir dönüş süresine sahiptir.
Introduction
Gen tahrikleri, tıbbi ve tarımsal alaka düzeyi 1 , 2 ,3,4,5böcek popülasyonlarını kontrol etmek için muazzam birpotansiyelesahiptir. Örneğin, CRISPR Cas nükleaslarına ve kılavuz RNA’lara (gRNA’lar) dayanan gen tahrik sistemleri, daha az bulaşma ve daha az hastalığa yol açan sıtma parazitlerine refrakterlik sağlayan özellikleri getirerek vektör sivrisinek popülasyonlarını değiştirmek için kullanılabilir1,4,5. Gen tahrik sistemi kendini ve ilişkili özelliği meiotik mikrop öncesi hücrelerde bir homolog kromozomdan diğerine kopyalar ve bu, yavruların çoğunluğunun sürücüyü devralmasını ve alanda uzun süreli ve sürdürülebilir popülasyon modifikasyonu potansiyeli yaratmasını sağlar. Bununla birlikte, Cas/gRNA tabanlı yöntemlerin bir dezavantajı, homolog olmayan son birleştirici (NHEJ) DNA onarımı yoluyla ekleme ve silme (indel) mutasyonları üretme olasılığıdır, bu da popülasyonda yeterince yüksek bir frekansa biriktiğinde tahrik sistemininyayılmasını durdurabilen sürücüye dayanıklı alellerin üretilmesine neden olur. . Bu protokol, Cas/gRNA tabanlı gen güdüsü sırasında hem popülasyon hem de bireysel düzeyde indel mutasyonlarının yaygınlığını ve göreceli miktarını belirleyebilen yüksek verimli ve güvenilir bir yöntemi detaylandırıyor.
Yeni nesil sıralama (NGS) yöntemleri benzersiz sıralama çözünürlüğü sağlar. Bununla birlikte, NGS ile ilişkili maliyet ve teknik gereksinimler rutin testleri yasaklar veindels 6,7,8’ideğerlendirmek için yüksek verimli bir yöntem olarak kullanımını sınırlar. Geleneksel PCR nicelleştirme yöntemleri uzun zamandır genom indelleri için standart değerlendirme prosedürü olarak kullanılmaktadır; ancak, bu yöntemler emek yoğundur, veri temini uzun zaman alır ve yüksek derecede değişkenliğe sahiptir. Digital-Droplet PCR (ddPCR) bazı uygulamalarda Sanger diziliminden daha hassas mutasyonları tespit etme konusunda daha hassas olduğu kanıtlanmıştır ve diğerlerinde NGS’den daha düşük bir algılama sınırına sahiptir6,7,8,9. Ayrıca, bir örnek seti değerlendirmenin maliyeti ve sonuç elde etmek için dönüş süresi, ddPCR için Sanger diziliminden veya NGS9’dandaha az pahalı ve daha hızlıdır. Çift problu bir sistem kullanan Bırakma tahlili, gRNA tarafından yönlendirilen hedef Cas9 kesim yerinde vahşi tip (WT) sırasının yokluğuna bağlı olarak NHEJ alellerini tanımlar. Bu testte, Cas/gRNA tabanlı sistemin öngörülen kesim bölgesini içeren kısa bir amplicon belirli bir astar çifti ile yükseltilir. Bir floresan prob amplicon’un korunmuş bir bölgesine bağlanmak için tasarlanmıştır ve başka bir floresan prob kesim bölgesinin WT sırasını tanır. Bir NHEJ alelesinin varlığında, ikincisi amplicon’a bağlanmaz.
DdPCR kullanımı, sivrisinek popülasyon analizlerinde NHEJ profillemesine izin verecek olan silmeleri, tek baz çifti farklılıklarını ve eklemeleri hedeflemek için astarlar tasarlama yeteneği sağlar9. Bu çekici özellikler göz önüne alındığında, sivrisineklerde Cas/gRNA tabanlı gen tahrik sisteminden oluşturulan indellerin yüksek verimli tespiti için ddPCR için bir protokol oluşturduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dijital damlacık PCR, Cas/gRNA tabanlı bir gen tahrik sisteminde NHEJ olaylarından kaynaklanan indel alellerinin varlığını belirlemek için etkili bir yöntemdir ve bireylerde veya popülasyonlarda bu alellerin sıklığının ölçülmesini sağlar. Güvenilir sonuçlar elde etmek için protokolün bazı adımlarının özel bir dikkatle takip edilmesi gerekir. Öncelikle, genomik DNA ekstraksiyonu, yüksek kalite ve yeterli miktarda sağlamak için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. İyi bir ekstraksiyon, reaksiyon başına haploid genom kopyalarının doğru bir şekilde belirlenmesini sağlayacaktır. Deneyimlerimize göre, piyasada bulunan bir kit (bkz. Malzeme Tablosu)sürekli olarak yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları sağladı. Bununla birlikte, bireysel sivrisineklerin ekstraksiyonları, DNA peletinin görselleştirilmesi zorlaştığından ve dikkatli olmazsa süpernatant ile kolayca emilebileceğinden özellikle zor olabilir. İkincisi, astarlar ve problar dikkatlice tasarlanmalıdır. DDPCR deneyini tamamlamadan önce, tasarlanan astarların önce geleneksel bir PCR gerçekleştirerek ve jel elektroforez yoluyla tek bir ürünü görselleştirerek tek bir PCR ürünüyle sonuçlandığından emin olun. Başvuru FAM probu da yüksek oranda korunmuş bir sıranın tamamlayıcısı olacak şekilde tasarlanmalıdır. Bu, farklı bir popülasyon boyunca WT alellerinin doğru şekilde algılanmasını sağlayacaktır. Her benzersiz deney için astar/prob kombinasyonları farklı termosikleyici koşullarına sahip olacaktır ve bu koşulların bir termal degrade kullanılarak optimize edilmesiniz önerilir.
Sanger dizilimi veya NGS gibi indelleri tanımlamak için başka yöntemler de vardır. Sanger dizilimi sınırlıdır, çünkü yeni varyantları tanımlamak için daha düşük bir algılama sınırına ve düşük keşif gücüne sahiptir. Sanger dizilimi de emek yoğundur ve yüksek verim değildir. Sanger dizilimi ile karşılaştırıldığında, NGS düşük hassasiyet, keşif gücü ve aktarım hızı ile aynı sınırlamalara sahip değildir. NGS’nin bir diğer faydası da tek nükleotid polimorfizmden (SNP’ ler) yeniden yapılanmalara kadar çeşitli mutasyonları tespit edebilmesidir. Bununla birlikte, NGS Cas9/gRNA ile ilişkili indellerin belirlenmesi uygulamasında daha maliyetli ve zaman alıcı bir yöntemdir, çünkü ilgi çekici tek bir hedef bölge vardır ve daha büyük genom çapında analizler için en uygun yöntemdir. Yukarıda belirtilen yöntemlerle karşılaştırıldığında, ddPCR yüksek aktarım hızına sahiptir ve hızlı bir dönüş süresine sahiptir. DdPCR malzemeleri ve aletleri şirket içinde mevcutsa, 96 numune 1-2 gün içinde işlenebilir, bu da Cas9 / gRNA modifiye organizmaların büyük denemelerinin hızlı analizi için çok uygundur.
ddPCR için birçok avantaj olsa da sınırlamalar da vardır. İlk olarak, ddPCR ekipmanı bağımsız bir laboratuvar ortamında sıkça bulunmaz. ddPCR ekipmanı daha büyük araştırma kurumlarında ortaklaşa mevcut olabilir, ancak bu, kurum dışında veri oluşturma ve analiz kolaylığına izin vermez. İkincisi, alternatiflerin aksine, ddPCR tanımlanan indel mutasyonlarının bireysel benzersiz dizilerini sağlamaz. Dijital damlacık PCR, bir popülasyondaki indel mutasyonlarının sıklığını sağlayacaktır, ancak dizi olmadan, mevcut indellerin ilgi geninin işlevini koruma veya engelleme olasılığının daha fazla olup olmadığını belirleyemez. DdPCR yöntemi, Cas9/gRNA tabanlı bir tahrik organizmasının alan serbest bırakma denemesinden sonra vahşi popülasyonları analiz etmek için belki de en uygun olanıdır, çünkü transjenin yerli popülasyona giriş sıklığını ve popülasyon içindeki indellerin neslini gerçek zamanlıya yakın bir şekilde verimli bir şekilde belirleyebilir. DdPCR hızlı dönüş süresi nedeniyle, malzemeler yerel olarak mevcutsa, bir saha deneme bölgesinde popülasyonu haftalık olarak örneklemek ve analiz etmek mümkün olacaktır. DdPCR ekipmanını satın almak, ithal etmek ve kurmak için başlangıç maliyetleri uzak laboratuvarlarda yüksek olacaktır, ancak bir tahrik sisteminden değişiklik gördüğü için vahşi bir popülasyonu titizlikle değerlendirebilmenin yararları maliyetleri haklı çıkaracaktır.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman Kaliforniya Üniversitesi Irvine Sıtma Girişimi tarafından sağlandı. AAJ, Irvine Kaliforniya Üniversitesi’nde Donald Bren Profesörüdür.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
Riferimenti
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).
- Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control. EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Wang, Z., et al. Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).
- Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection. Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).
- Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi. Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).
- Holt, R. A., et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298 (5591), 129-149 (2002).
