遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

1. DNA抽出 500 μL の NLS と 1 サンプル当たり 120 μL の比率で、EDTA/核ライシスバッファー (EDTA/NLS) を準備します。複数のサンプルのスケールアップ。氷の上で混合物を冷やします。注:溶液は、ボリュームに応じて冷やすと2〜5分で曇りになります。 冷却されたEDTA / NLSの600 μLで満たされた1.5 mLマイクロ遠心分離管で10-15 sのための機械ホモジナイザーを使用して蚊のサンプルを均質化;よく混ぜます。 20 mg/mL の 20 mg/mL の 17.5 μL をチューブに加え、十分に混ぜます。 55°Cで一晩インキュベートする。 あるいは、55°Cで3時間、サンプルを1時間ごとに振り、渦を入れインキュベートする。 200 μLのタンパク質沈殿液を室温サンプルに加え、渦を20秒に激しく加えます。 サンプルを氷の上で5分間冷やします。 サンプルをペレットタンパク質に遠心分離して、15,890 RCFで4分間用いた。 DNAを含む上澄み物を慎重に吸引し、600 μLのイソプロパノールを含むクリーンな1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。 チューブを5~10回反転して溶液を軽く混ぜます。15,890 RCFで1分間の遠心分離機。DNAペレットを保存しながら上清を慎重にデカントします。 600 μLの室温 70% エタノールを加えます。ペレット化したDNAを、チューブを軽く反転させて洗浄します。 15,890 RCFで1分間の遠心分離機。ガラスピペットチップを使用して吸引して上清を慎重に除去します。 チューブをきれいな吸収性の紙に反転させ、ペレットを10〜15分間空気乾燥させます。 DNAをPCRグレードの水で再懸濁します。1個の蚊のサンプルにつき20μL、10個のプールされた蚊に100 μLを使用してください。注:市販のキットを使用した蚊のサンプルのDNA抽出方法( 材料表を参照)は、組織培養細胞および動物組織プロトコルからゲノムDNAを分離するメーカーから適応されています。 2. ddPCR反応と液滴生成製剤 フルオメーターを使用してDNAを定量化します。注:ドロップオフアッセイでは、ターゲットカット部位のWT配列に結合し、ターゲットサイトで欠失または挿入がある場合はアニール(ドロップオフ)しないHEXラベリングプローブでNHEJイベントを検出するように設計された、反応ごとに3,000〜30,000のハプロイドゲノムコピーの範囲を使用することをお勧めします。 NHEJ バリアントの存在を示します。 抽出物中のdnaのハプロイドゲノム重量と濃度を用いてコピー数を計算する。これは、抽出されたDNAの濃度と全DNA質量を得るために使用される体積を掛け、それをハプロイドゲノム重量で割ることによって行われる。推奨されるハプロイドゲノムコピー範囲内に入るために必要に応じて、追加されたボリュームが1〜10 μLの間にあることを確認します。注:1つの アノフェレスガンビアハ プロイドゲノムは、成虫蚊10あたり0.27 pgであると推定される。 プライマーとプローブを設計します。150-400 bpのアンプリコンを生成するgRNA標的部位の5′-および3’末端に隣接する55〜60°Cの範囲のプライマー融解温度(Tm)を有する前方および逆オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。 16進数(ヘキサクロロ-フルオレセイン)-NHEJ検出用プローブ:標的部位に相補的な長さが15~20bpのオリゴヌクレオチドを設計し、HEXプローブを5’エンドに、BHQ1(BLackホールクエンチャー1)を3’末端に加えます。加水分解プローブのTmは、プライマーのTmよりも3〜10°C高くする必要があります。 FAM(6-カルボキシフルオレセイン)標識プローブ(参照WT用):オリゴヌクレオチドを、標的部位から遠く離れた保存ゲノム部位(約25bp)に補長のオリゴヌクレオチドを設計し、FAMプローブを5’末端に、BHQ1を3’末端に追加します。加水分解プローブのTmは、プライマーのTmよりも3〜10°C高くする必要があります。 3. PCR反応の準備 ddPCR サンプルミックスの 25 μL を次のコンポーネントで準備します: プローブ用 ddPCR スーパーミックス (UTP なし): 12.5 μL、 フォワードおよびリバースプライマー(10 μM):1 μL、HEX/FAMプローブ(10 μM):それぞれ0.625 μL、DNA:1-5 μL(3,750-37,500 haploidゲノムコピー)および水:最大25μL。 反応を、渦巻きまたは還流ピペット(上下)(20倍)で十分に混合します。注:反応が96ウェルプレートにある場合は、気泡の形成を避けるために渦を巻くのではなく、体積全体を上下に20回ピペットします。 サンプルを簡単に遠心分離して、混合物をチューブの底部またはウェルで沈着させる。注:液滴生成のための反応が室温であることを確認してください。各カートリッジに余分な/未使用のウェルを用意するために、1xのddPCRミックスを準備します(各カートリッジには8つのウェルがあります)。 4. 液滴発生 50 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、ddPCR サンプルの 20 μL をカートリッジの中央の行に混合します(図 1A、上)。 オイルの70 μLを下の列に積み込みます。未使用のウェルに1x ddPCRスーパーミックスの20 μLをロードします。注意:気泡を導入しないでください。 ガスケットをエッジのみに触れ、中央の凹面領域を避けます(図1B)。 プレートを液滴発生器にしっかりと置き、カバーを閉じて実行を開始します。 マルチチャンネルピペットを使用して、カートリッジの上段(図1A、下)から96ウェルプレートにエマーシオンミックスの40 μLを移します。 45~30°の角度で3~5sの液体サンプルを描きます。混合物を45°の角度で3s以上ゆっくりとウェルの側面に出して、側面に滴り落ちるようにします。すべての液体を排出するためにピペットの第二の停止(完全な追放)に行くのは大丈夫です。 ホイルヒートシールを使用し、180°Cで5sのプレートを密封します。 5. PCR 密封プレートをサーモサイクラー(図1C)に入れ、NHEJドロップオフガイドラインに従う場合は、推奨PCR条件を次のように設定します。 95°Cで10分間の初期変性。 変性する場合は94°Cの40サイクル、アニールに1分間55°C、延長する場合は60°Cを2分間設定します。 98°Cで10分間保持します。 4 °Cで保持します。注: 特定のプライマーおよびプローブセットのアニーリング温度は、熱勾配を使用して最適化できます。すべてのステップに2°C/sのランプレートを使用してください。PCR条件は、各実験計画とセットアップに応じて調整する必要があります。 6. 液滴の読み取り プレートを左上にA-1(平滑化されたコーナー、他の3つは縁取り)で液滴リーダーにしっかりと置きます(図1D)。 プログラムでプレートを設定する: 既知の参照チャネルとして FAM を指定し、HEX を未知のチャネルとして指定する (図 2A)。 直接定量として液滴読み取り実験を実行します。実行が完了したら、分析の [実験の種類] を[ドロップオフ(DOF)] に変更します (図 2A)。 7. 分析 正しい実験パラメータを指定します (図 2A):サンプル情報,SuperMix,ターゲット名(WTまたはNHEJ),ターゲットタイプ(参照または不明)),信号Ch1(HEXまたはFAM)、シグナルCh2(HEXまたはFAM)、および手動で液滴数のしきい値を設定します(信頼できる結果を得るには10,000以上を推奨)。ソフトウェアは、指定されたパラメータを使用してほとんどの解析を実行します。 ドロップレットタブで ドロップレット 数を確認します。すべてが 10,000 を超えているようにしてください (図 2B)。 陰性からの効率的な信号分離のために1 D振幅を点検して下さい。 プレート エディタでプレート全体をハイライト表示し、[ 実験タイプ ] を [ドロップ オフ]に設定します。 WT ターゲットを 参照として設定し、FAM 用のチャネル 1 を指定し、HEX 用にチャネル 2 を指定します。 NHEJ ターゲットを不明として設定し、FAM 用のチャネル 1 とチャネル 2 を none に指定します。 [2D 振幅] タブで、各サンプルのグラフ ツールを使用して クラスターのしきい値 を設定します。WT クラスターに関連付けられているテールを検討してください。これは、NHEJアッセイ(図3A)では正常です。注: [比率]タブで、グラフの右上にある歯車アイコンをクリックします。[分数の豊かさ]を選択します。グラフは、NHEJ イベントの割合に対応するポイントをプロットします (図 3B)。