PCR numérique par gouttelettes pour détecter les mutations indels dans les populations de moustiques anophélines génétiquement modifiés

1. Extraction de l’ADN Préparer le tampon de lyse EDTA/Nuclei (EDTA/NLS) avec un rapport de 500 μL de NLS et de 120 μL d’EDTA par échantillon. Mise à l’échelle pour plusieurs échantillons. Refroidir le mélange sur de la glace.REMARQUE: La solution deviendra trouble en 2-5 min lorsqu’elle est refroidie en fonction du volume. Homogénéiser l’échantillon de moustiques à l’aide d’un homogénéisateur mécanique pendant 10 à 15 s dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL rempli de 600 μL d’EDTA/NLS réfrigéré; Mélanger. Ajouter 17,5 μL de 20 mg/mL de protéinase K dans le tube et bien mélanger. Incuber toute la nuit à 55 °C. Alternativement, incuber l’échantillon à 55 °C pendant 3 h en agitant et en tourbillonnant l’échantillon toutes les 1 h. Ajouter 200 μL de solution de précipitation protéique à l’échantillon à température ambiante et vortexer vigoureusement pendant 20 s. Refroidir l’échantillon pendant 5 min sur de la glace. Centrifuger l’échantillon en protéines granulées à 15 890 FCR pendant 4 min. Aspirer soigneusement le surnageant qui contient l’ADN et le transférer dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 mL contenant 600 μL d’isopropanol. Mélangez doucement la solution en inversant le tube 5 à 10 fois. Centrifugeuse pendant 1 min à 15 890 RCF. Décantez soigneusement le surnageant tout en préservant la pastille d’ADN. Ajouter 600 μL d’éthanol à température ambiante à 70 %. Lavez l’ADN granulé en inversant doucement le tube. Centrifugeuse pendant 1 min à 15 890 RCF. Retirez soigneusement le surnageant par aspiration à l’aide d’une pointe de pipette en verre. Inverser le tube sur du papier absorbant propre et sécher la pastille à l’air libre pendant 10 à 15 min. Resuspendez l’ADN avec de l’eau de qualité PCR. Utilisez 20 μL par échantillon de moustique individuel ou 100 μL pour 10 moustiques regroupés.REMARQUE: Les méthodes d’extraction de l’ADN pour les échantillons de moustiques à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux)sont adaptées du protocole isolation de l’ADN génomique des cellules de culture tissulaire et des tissus animaux du fabricant. 2. Réactions ddPCR et préparation de la génération de gouttelettes Quantifier l’ADN à l’aide d’un fluoromètre.REMARQUE: Pour le test de dépôt, il est recommandé d’utiliser une plage de 3 000 à 30 000 copies du génome haploïde par réaction, conçue pour détecter les événements NHEJ avec une sonde de marquage HEX qui se lie à une séquence WT du site de coupe ciblé et ne recuit pas (chute) en cas de délétion ou d’insertion sur le site cible, indiquant la présence d’une variante NHEJ. Calculez le nombre de copies en utilisant le poids du génome haploïde et la concentration d’ADN dans l’extrait. Cela se fait en multipliant la concentration de l’ADN extrait par le volume utilisé pour obtenir la masse totale d’ADN, puis en la divisant par le poids du génome haploïde. Assurez-vous que le volume ajouté est compris entre 1 et 10 μL. Diluer au besoin pour être dans la plage de copie du génome haploïde recommandée.REMARQUE: Un génome haploïde d’Anopheles gambiae est estimé à 0,27 pg par moustique adulte10. Concevoir des amorces et des sondes. Concevoir des amorces d’oligonucléotides avant et arrière avec une température de fusion de l’amorce (Tm) comprise entre 55 et 60 °C qui flanquent les extrémités 5′ et 3′ du site cible de l’ARNg produisant un amplicon de 150-400 bp. Sonde marquée HEX (Hexachloro-fluorescéine) pour la détection NHEJ : Concevoir un oligonucléotide d’environ 15-20 bp de longueur complémentaire au site cible et ajouter la sonde HEX à l’extrémité 5′ et BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) à l’extrémité 3′. La Tm de la sonde d’hydrolyse doit être supérieure de 3 à 10 °C à la Tm des amorces. Sonde marquée FAM (6-carboxyfluorescéine) pour référence WT: Concevoir un oligonucléotide ~15-20 bp de longueur complémentaire à un site du génome conservé éloigné (environ 25 bp) du site cible et ajouter la sonde FAM à l’extrémité 5′ et BHQ1 à l’extrémité 3′. La Tm de la sonde d’hydrolyse doit être supérieure de 3 à 10 °C à la Tm des amorces. 3. Préparation de la réaction PCR Préparer 25 μL du mélange d’échantillons ddPCR avec les composants suivants : supermélange ddPCR pour sondes (pas d’UTP) : 12,5 μL, amorces avant et arrière (10 μM) : 1 μL chacune, sondes HEX/FAM (10 μM) : 0,625 μL chacune, ADN : 1-5 μL (3 750-37 500 copies du génome haploïde) et eau : jusqu’à 25 μL. Bien mélanger les réactions par vortex ou pipetage par reflux (haut et bas) (20x).REMARQUE: Si les réactions sont dans une plaque de 96 puits, pipettez tout le volume vers le haut et vers le bas 20 fois plutôt que de vortexer pour éviter la formation de bulles. Centrifugez brièvement les échantillons pour déposer le mélange au fond du tube ou du puits.REMARQUE: Assurez-vous que les réactions sont à température ambiante pour la génération de gouttelettes. Préparez 1x de mélange ddPCR pour les puits supplémentaires / inutilisés dans chaque cartouche (chaque cartouche a 8 puits). 4. Génération de gouttelettes À l’aide d’une pipette multicanal de 50 μL, chargez 20 μL du mélange d’échantillon ddPCR dans la rangée centrale de la cartouche(Figure 1A,en haut). Chargez 70 μL d’huile dans la rangée du bas. Chargez 20 μL de 1x supermélange ddPCR dans des puits inutilisés.REMARQUE: N’introduisez pas de bulles. Placez le joint en touchant uniquement les bords, en évitant la zone concavée centrale (Figure 1B). Placez la plaque solidement dans le générateur de gouttelettes et fermez le couvercle pour commencer la course. À l’aide de la pipette multicanal, transférer 40 μL du mélange d’émersion de la rangée supérieure de la cartouche(Figure 1A,en bas) dans la plaque de 96 puits. Prélever un échantillon liquide pendant 3-5 s à un angle de 45-30°. Expulsez le mélange lentement pendant plus de 3 s à un angle de 45° sur le côté du puits, ce qui lui permet de s’égoutter sur le côté. Il est acceptable d’aller au deuxième arrêt (expulsion complète) de la pipette pour expulser tout le liquide. À l’aide de joints thermiques en aluminium, sceller les plaques pendant 5 s à 180 °C. 5. PCR Placez la plaque scellée dans le thermocycleur(Figure 1C)et réglez les conditions de PCR recommandées si vous suivez les directives de dépôt NHEJ comme suit: Dénaturation initiale à 95 °C pendant 10 min. Réglez 40 cycles de 94 °C pendant 30 s pour dénaturer, 55 °C pendant 1 min pour recuit et 60 °C pendant 2 min pour prolonger. Maintenir à 98 °C pendant 10 min. Maintenir à 4 °C.REMARQUE: La température de recuit pour des amorces et des ensembles de sondes spécifiques peut être optimisée à l’aide d’un gradient thermique. Utilisez un taux de rampe de 2 °C/s pour toutes les étapes. Les conditions de PCR doivent être ajustées en fonction de chaque conception expérimentale et de chaque configuration. 6. Lecture des gouttelettes Placez la plaque solidement dans le lecteur de gouttelettes avec le puits A-1 en haut à gauche (coin lissé, les trois autres sont bordés) (Figure 1D). Configurer la plaque dans le programme : Désignation de FAM comme canal de référence connu et HEX comme canal inconnu(Figure 2A). Exécutez l’expérience de lecture Droplet en tant que quantification directe. Une fois l’exécution terminée, remplacez le type d’expérience par Drop-Off (DOF) pour l’analyse (Figure 2A). 7. Analyse Désignez les paramètres expérimentaux corrects(Figure 2A): Informations sur l’échantillon, SuperMix, Nom de la cible (WT ou NHEJ), Type de cible (Ref ou Inconnu), Signal Ch1 (HEX ou FAM), Signal Ch2 (HEX ou FAM), et définissez manuellement le seuil de nombre de gouttelettes (recommander au-dessus de 10 000 pour des résultats fiables). Le logiciel effectuera la majeure partie de l’analyse avec le paramètre désigné. Vérifiez le nombre de gouttelettes dans l’onglet Gouttelettes; s’assurer que tous sont au-dessus de 10 000(figure 2B). Vérifiez l’amplitude 1 D pour une séparation efficace du signal des négatifs. Dans l’éditeur de plaques, mettez en surbrillance la plaque entière et définissez le Type d’expérience sur Déposer. Définissez la cible WT comme référence,en désignant le canal un pour FAM et le canal deux pour HEX. Définissez la cible NHEJ comme inconnue, en désignant le canal un pour FAM et le canal deux comme aucun. Dans l’onglet Amplitude 2D, définissez les seuils de cluster avec les outils graphiques pour chaque échantillon. Considérons la queue associée à l’amas WT; ceci est normal pour les tests NHEJ (Figure 3A).REMARQUE: Sous l’onglet Ratio, cliquez sur l’icône d’engrenage en haut à droite du graphique. Sélectionnez l’abondance fractionnaire. Le graphique va maintenant tracer un point correspondant au pourcentage d’événements NHEJ (Figure 3B).