Abordagens de Inteligência Artificial para avaliar cilia primária

Treinamento de IA para identificar cíliosMedir e avaliar o comprimento e a composição estruturais de Cílios pode ser um processo tedioso, demorado e propenso a erros. Aqui, usamos a ia para segmentar com precisão cílios de um grande pool de imagens e analisar seus comprimentos e intensidades com uma ferramenta de análise(Figura 1). Todas as abordagens de IA requerem passos de treinamento para sua implementação. Estabelecemos um pipeline de treinamento para reconhecer a cílio, que foi realizada aplicando manualmente máscaras binárias em estruturas ciliares. Essas informações são então usadas para treinar a IA com base nas características dos pixels sob os binários aplicados. Como diretriz geral, o treinamento envolve o software passando por várias iterações, aproximadamente 1000, e é considerado ótimo se a perda de treinamento ou taxa de erro for inferior a 1%. No entanto, o número de iterações e erros no processo de treinamento pode variar dependendo das imagens amostrais utilizadas para treinamento. Por exemplo, após nossas sessões de treinamento usando imagens de cílios neuronais in vitro, a taxa de erro foi de 1,378% em comparação com 3,36% para imagens da seção cerebral in vivo (Figura Suplementar 1). Uma vez concluído o treinamento, a IA pode então ser usada para segmentar cílios a partir de imagens experimentais em segundos e as máscaras binárias resultantes são usadas para medir parâmetros estruturais. Isso elimina a necessidade de segmentar objetos usando o método tradicional de limiar de intensidade que pode ser difícil em imagens com alto ruído de fundo ou quando objetos estão próximos um do outro. A IA também reduz o potencial de erro e viés aplicando o mesmo algoritmo em todas as imagens, independentemente do usuário. Medindo o comprimento da cília usando GA3O comprimento da cília é fortemente regulado e está associado a impactos funcionais na sinalização ciliar16,19. Aqui, medimos os comprimentos de cilia usando um pipeline de análise dentro do software NIS Elements chamado General Analysis 3 ou GA3. O GA3 ajuda a combinar múltiplas ferramentas em um único fluxo de trabalho para construir rotinas personalizadas para cada experimento. Começamos medindo comprimentos de cílios em uma linha celular. As células do ducto coletor interno do camundongo (IMCD-3) foram imunolabelladas com tubulina acetilada e imagens usando um microscópio confocal. Medimos os comprimentos de cília utilizando GA3 após a segmentação com segment.ai (Figura Suplementar 3A). Embora acetilada α-tubulina seja preferencialmente encontrada no cílio primário, ela também é encontrada em outras regiões ricas em microtúbulos, como o citoesqueleto, bem como a ponte citocinética. O Ai treinado identificou lília na imagem, mas não outras estruturas positivas não ciliares e acetiladas. Cília em células IMCD variou de 0,5 μm a 4,5 μm com um comprimento médio de 1,8 ± 0,04 μm(Figura 2A). Em seguida, testamos a capacidade de Ai de medir comprimentos de cílios em culturas neuronais primárias. Nós cultivaram neurônios do hipotálamo e hipocampo de camundongos neonatais por 10 dias e os imunolabellamos com o marcador cília adenilato cyclase III (ACIII)21,41. Ao analisar culturas neuronais, achamos útil aplicar um filtro antes de analisar estatisticamente os comprimentos. Devido a uma menor relação sinal/ruído, vários objetos com menos de 1 μm não eram cílios. Por isso, filtramos os dados para eliminar quaisquer objetos com menos de 1 μm de comprimento para garantir que apenas lírios fossem analisados. Em neurônios hipotalâmicos cultivados, os comprimentos de cílio variaram de 2 μm a 7 μm com um comprimento médio de 3,8 ± 0,19 μm(Figura 2B). Curiosamente, a cília neuronal hipocampal cultivada foi maior com um comprimento médio de 6,73 ±0,15μm(Figura 2C). Tem sido relatado que diferentes núcleos neuronais dentro do hipotálamo apresentam comprimentos de cílios distintos e que estes cílios alteram seus comprimentos em resposta a alterações fisiológicas de forma específica do núcleo19,23. Por isso, também rotulamos seções cerebrais hipotalâmicas de camundongos adultos C57BL/6J com ACIII e imagem do núcleo arcuato (ARC) e núcleo paraventricular (PVN). Utilizando GA3 para medir comprimentos de cílio, observamos que a cália hipotalâmica in vivo apareceu mais longa do que a cília in vitro. Especificamente, cilia hipotalâmica in vivo variam de 1 μm a cerca de 15 μm(Figura 3). Não houve diferenças significativas entre os comprimentos de cílios no PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) e os do ARC (6,16 ± 0,27 μm)(Figura 3C)23. Da mesma forma, cílios na região de cornu ammonis (CA1) do hipocampo exibem uma faixa de comprimento mais estreita de 1 μm a 10 μm com um comprimento médio de 5,28 ± 0,33 μm(Figura 3). De acordo com estudos publicados anteriormente, nossa análise utilizando ferramentas de IA e GA3 mostrou que cílios de diferentes regiões cerebrais mostram diversidade no comprimento19,23. Além disso, usando esta abordagem de IA, somos capazes de avaliar rapidamente um grande número de cílios. Medição da composição de cílios usando GA3O cílio primário é um centro de sinalização para muitas vias que utilizam diversos tipos de proteínas para realizar funções únicas, como proteínas motoras, proteínas de transporte intraflagellar e GPCRs para citar alguns3,24,42,43. Manter os níveis adequados dessas proteínas dentro do cílio é importante para o bom funcionamento e muitas vezes parece dependente do contexto celular. A rotulagem fluorescente dessas proteínas não só nos permitiu visualizá-las, mas também quantificar suas intensidades como medida da quantidade da proteína rotulada dentro do compartimento relativamente pequeno20. Por isso, buscamos determinar as intensidades de um GPCR ciliar, Melanin Concentrando o Receptor Hormonal 1 (MCHR1), in vivo tanto no ARC quanto no PVN do hipotálamo de camundongos machos adultos24,44. Utilizando Ai e GA3, medimos os comprimentos da cília positiva MCHR1, juntamente com as intensidades para garantir que os objetos que estão sendo contados fossem cílios (Figura Suplementar 3A). Eliminamos objetos pós-análise com menos de 2 μm de comprimento e analisamos intensidades de máscaras binárias remanescentes. Curiosamente, descobrimos que a intensidade do Ciliary MCHR1 em PVN é significativamente maior do que a do ARC indicando uma presença mais forte de mchr1 ciliar em PVN (Figura 4). Outros estudos são necessários para determinar a significância do Ciliary MCHR1 nesses circuitos neuronais. Também medimos as intensidades do Ciliary MCHR1 em neurônios cultivados primários de hipotálamo e hipocampo. Cílias de ambas as culturas apresentam uma ampla distribuição das intensidades do MCHR1 sugerindo a presença de populações neuronais heterogêneas(Figura Suplementar 2). Assim, o uso de ferramentas analíticas sofisticadas como aI e o GA3 permite a avaliação da heterogeneidade cílio dentro do mesmo tecido ou entre múltiplos tecidos. Será interessante ver se outros GPCRs neuronais apresentam diferenças semelhantes em sua localização dentro de neurônios do mesmo tecido e se isso altera em resposta a alterações fisiológicas. ColocalizaçãoEmbora medir as intensidades de fluorescência dentro de um campo de imagem completo possa dar uma impressão de proteína, ela não fornece informações como distribuição espacial ou proximidade com outras proteínas e estruturas celulares próximas. Aqui, medimos a sobreposição de MCHR1 com ACIII como um marcador de lília, plotando as intensidades do MCHR1 contra a da ACIII para cada máscara binária(Figura 5). O gráfico mostra que a maioria dos cílios são positivos para ambos, ACIII e MCHR1, embora alguns cilias mostrem expressão mais forte de um canal sobre o outro. Além disso, existem alguns cílios que mostram a presença de ACIII ou MCHR1, como é evidente a partir dos pontos que estão diretamente no eixo x e no eixo y, respectivamente. Para quantificar essa sobreposição, medimos o coeficiente de sobreposição de Mander e comparamos a extensão da expressão MCHR1 em cólia neuronal do ARC e PVN40. Curiosamente, nossa análise revelou que houve um aumento significativo nos coeficientes do PVN (0,6382 ± 0,0151) do que os do ARC (0,5430 ± 0,0181) (Figura 5C). Isso é consistente com nossos dados anteriores, onde observamos maiores intensidades de MCHR1 em PVN em comparação com ARC (Figura 4). Esses dados sugerem que, como o comprimento da cília, o padrão de expressão do MCHR1 no compartimento ciliar varia em diferentes regiões do cérebro. Usando o mesmo pipeline de análise, será possível determinar se outros GPCRs ciliares como Neuropeptide Y Receptor Tipo 2 (NPY2R) e Somatostatin Receptor Tipo 3 (SSTR3) mostram quantidades semelhantes de diversidade. Medindo o perfil de intensidade ao longo do cílioUma vez identificada a cília utilizando segment.ai, a receita GA3 pode ser modificada para combinar análise de cílios com identificação de outras estruturas de interesse na imagem. Por exemplo, rotular com marcadores corporais basais é útil para a identificação da polaridade cílio. Para fazer essa análise, nós imaginamos seções cerebrais hipotalâmicas de camundongos P0 que expressam ARL13B-mCherry e Centrin2-GFP e imagem do ARC e PVN34. Aqui, a cília foi identificada utilizando Ai como antes, mas agora a receita ga3 modificada inclui a identificação do Centrin2-GFP, uma proteína centrílar encontrada na base do cílio (Figura Suplementar 3B). Rotulando Centrin2-GFP, a base de cílios pode ser distinguida das pontas de ARL13B-mCherry positive cilia(Figura 6A). Então, em vez de medir a intensidade dentro de toda a cília, somos capazes de medir mudanças na intensidade ARL13B ao longo do comprimento da cília (Figura 6B). Também podemos comparar diferenças na intensidade do ARL13B entre as extremidades proximais e as extremidades distal das cílias. Para isso, dividimos o comprimento do círio em caixas de 1 mícnico a partir da base e designamos a primeira caixa de micron como a extremidade proximal e a última caixa de mícula como a extremidade distal. Nossa análise revelou que há significativamente mais ARL13B presente mais perto da base do que a ponta do cílio tanto no ARC quanto no PVN, e isso é consistente com estudos publicados anteriormente em condrócitos humanos45 (Figura 6C). Neste tipo de análise, em vez de aplicar um filtro de comprimento para excluir pequenos objetos não ciliares da análise, apenas cílios associados à rotulagem Centrin2-GFP são analisados. Isso pode ser vantajoso em situações onde mutações genéticas tornam cílios muito curtos, ou se mudanças em subdomínios de cílios como a zona de transição ou ponta foram implicadas. A identificação da cília utilizando a análise de IA e GA3 é altamente adaptável e pode ser adaptada para atender a uma variedade de questões complexas de pesquisa. Figura 1. Fluxo de trabalho para medir o comprimento e intensidade da cília usando a IA. (A) Para treinar o IA, binários são desenhados em torno dos objetos de interesse (cílios) nas imagens de treinamento bruto. Usando os binários desenhados, o Segmento Ai é treinado para reconhecer a forma e intensidades de pixels da cília. (B) Em seguida, o segmento ai treinado é aplicado a imagens experimentais brutas. Ele atrai binários em objetos que reconhece como cílios. Esses binários podem ser refinados para garantir que todos e apenas cílios estejam sendo analisados. (C) Um programa GA3 é construído para analisar a intensidade e o comprimento dos objetos reconhecidos pela IA. (D) Os registros são importados em uma tabela no software. Esta tabela pode então ser exportada para análise posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Medições in vitro de comprimento de cílios. Imagens representativas de células IMCD (verde, tubulina acetilada) (B)culturas hipotalâmicas primárias (verde, ACIII) e(C)culturas hipocampais (verde, ACIII). Um ia treinado foi usado para reconhecer cílios como mostrado na máscara binária (magenta) e, em seguida, GA3 foi usado para medir o comprimento da cília. A distribuição do comprimento do cílio é grafada como percentual de cílios em 0,5 ou 1,0 mícrons de lixeiras. * indica ponte citocinética devidamente não reconhecida pela IA. n=225 cílios em células IMCD de 3 réplicas, 54 cílias em hipotalâmica e 139 cílias em culturas hipocampais de 3 animais. Barras de escala 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. Medições de comprimento in vivo cilia. (A) Imagens representativas de cílios (verde, ACIII) no ARC, PVN e CA1 de seções cerebrais de camundongos adultos. (B) Um Ai treinado em NiS Elements foi usado para reconhecer cílios como mostrado na máscara binária (magenta) e, em seguida, GA3 foi usado para medir o comprimento de cílio. (C) A distribuição do comprimento da cília é grafada como porcentagem de cílios em caixas de um mícnico. n= 68 cílios em ARC, 36 em PVN e 29 em CA1 de 3 animais. Barras de escala 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Ai auxiliou as medidas de intensidade de coloração de cílios de cilia neuronal hipotalâmica. (A) Imagens representativas de cílios (MCHR1, vermelho) no ARC e PVN de seções cerebrais de camundongos adultos. Um Ai treinado em NIS Elements foi usado para reconhecer cílios como mostrado na máscara binária (ciano) e, em seguida, GA3 foi usado para medir a intensidade da coloração MCHR1 em cílios. (B) As intensidades do MCHR1 são grafadas como média ± S.E.M. Cada ponto representa um cílio. * p < 0,05, teste t do aluno. (C) A distribuição da intensidade do MCHR1 é grafada como percentual de cílios em lixeiras de 0,2 x 107 Unidades Arbitrárias (A. U.). n= 53 cílios em ARC, 78 em PVN de 3 animais. Barras de escala 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5. Ai auxiliou na análise de colocalização de cílios. (A, B) Imagens representativas de cílios no ARC e PVN, respectivamente. Cílias são rotuladas com ACIII (verde) e MCHR1 (vermelho). Um Ai treinado em NIS Elements foi usado para reconhecer cílios como mostrado na máscara binária (magenta para ACIII rotulado cilia, ciano para MCHR1 rotulado cílio). O GA3 foi usado para reconhecer cílios que continham tanto a ACIII quanto o MCHR1. (C) Os valores do coeficiente de sobreposição de manders (MOC) são gráficos como ± média S.E.M. Cada ponto representa um cílio. * p < 0,05, teste t do aluno. (D) Dispersar a intensidade de MCHR1 vs. intensidade ACIII em ARC e PVN. Cada ponto representa um cílio. n= 72 cílios em ARC, 47 em PVN de 3 animais. Barras de escala 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6. Análise cilia e corpo basal. (A) Imagens representativas de cílios (vermelho, ARL13B-mCherry) e marcador de corpo basal (verde, Centrin2-GFP) no ARC e PVN de ratos P0. Um ia treinado foi usado para reconhecer cílios como mostrado na máscara binária (ciano). A máscara binária para corpo basal (magenta) foi desenhada por limiar na receita GA3. (B) Intensidade de varredura da linha representativa de um cílio. (C) As intensidades de ARL13B nas extremidades proximal e distal da IA identificaram cílios gráficos como ± média S.E.M. As extremidades proximal e distal são definidas como a região dentro do primeiro comprimento de 1 μm e o último comprimento de 1 μm, respectivamente, a partir da base do círio. Cada ponto representa um cílio. * p < 0,05. n = 6 cílios em ARC de 2 animais e 21 cílios em PVN de 3 animais. Barras de escala 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura suplementar 1. Gráficos de perda de treinamento de IA. (A, B) Gráficos mostrando perda de treinamento de segment.ai em cílios neuronais in vitro e in vivo, respectivamente. Clique aqui para baixar este Arquivo. Figura suplementar 2. Ai Auxiliado Cilia medições de intensidade de intensidade de cormentação in vitro neuronal . (A, B) Imagens representativas de cílios (MCHR1, vermelho) em culturas hipotalâmicas e hipocampais primárias, respectivamente. Um Ai treinado em NIS Elements foi usado para reconhecer cílios como mostrado na máscara binária (ciano) e, em seguida, GA3 foi usado para medir a intensidade da coloração MCHR1 em cílios. A distribuição da intensidade do MCHR1 é grafada como porcentagem de cílios em 1000 caixas de 1000 U. para caixas hipotalâmicas e 2000 a. U. para culturas hipocampais. n= 30 cílios em hipotalâmica e 106 cílias em culturas hipocampais de 3 animais. Barras de escala 10 μm. Clique aqui para baixar este Arquivo. Figura suplementar 3. Análise Geral 3 receitas para análise de cílios. (A) Receita de Análise Geral Simples (GA3) para medição do comprimento, intensidade e coeficiente de Mander. (B) Receita ga3 complexa para medição de intensidade ao longo do comprimento do cílio utilizando um marcador para o corpo basal. Clique aqui para baixar este Arquivo.