1차 섬모 평가에 대한 인공 지능 접근 방식

섬모를 식별하기 위해 Ai 교육섬모 구조 길이및 조성물을 측정하고 평가하는 것은 지루하고 시간이 많이 걸리며 오류가 발생하기 쉬운 과정이 될 수 있습니다. 여기서는 Ai를 사용하여 큰 이미지 풀에서 섬모를 정확하게 분할하고 분석도구(그림 1)로길이와 강도를 분석합니다. 모든 Ai 접근 방식에는 구현을 위한 교육 단계가 필요합니다. 우리는 섬모 구조에 이진 마스크를 수동으로 적용하여 수행 된 섬모를 인식하는 교육 파이프 라인을 설립했습니다. 그런 다음 이 정보는 적용된 바이너리 아래의 픽셀 특성에 따라 Ai를 학습하는 데 사용됩니다. 일반적인 지침으로, 교육은 몇 가지 반복을 통해 가는 소프트웨어를 포함, 약 1000, 교육 손실 또는 오류 비율이 미만 경우 최적의 것으로 간주됩니다 1% 미만. 그러나 교육 프로세스의 반복 및 오류 수는 학습에 사용되는 샘플 이미지에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 시험관 내 신경 섬모 이미지를 사용하여 훈련 세션 후, 오차율은 생체 내 뇌 단면 이미지(보충도 1)의경우 3.36%와 비교하여 1.378%였다. 교육이 완료되면 Ai를 사용하여 실험 이미지에서 섬모를 몇 초 이내에 분할할 수 있으며, 그 결과 이진 마스크는 구조적 파라미터를 측정하는 데 사용됩니다. 이렇게 하면 배경 노이즈가 높거나 개체가 서로 가까이 있는 이미지에서 어려울 수 있는 기존의 강도 임계값을 사용하여 객체를 분할할 필요가 없습니다. 또한 Ai는 사용자에 관계없이 모든 이미지에 동일한 알고리즘을 적용하여 오류 및 바이어스 가능성을 줄입니다. GA3를 사용하여 섬모 길이 측정섬모 길이는 엄격하게 조절되며 섬모 신호16,19에기능적 영향과 관련이 있다. 여기서는 일반 분석 3 또는 GA3라는 NIS Elements 소프트웨어 내의 분석 파이프라인을 사용하여 섬모 길이를 측정했습니다. GA3는 단일 워크플로우에 여러 도구를 결합하여 각 실험에 맞게 사용자 지정된 루틴을 빌드하는 데 도움이 됩니다. 우리는 세포주에서 섬모 길이를 측정하여 시작했습니다. 마우스 내부 수질 수집 덕트(IMCD-3) 세포에 대한 섬모는 아세틸화된 튜불린으로 면역 라벨을 부착하고 공초점 현미경을 사용하여 이미지화하였다. segment.ai(보충도 3A)로분할한 후 GA3를 사용하여 섬모 길이를 측정했습니다. 아세틸화된 α-튜룰린이 1차 실륨에서 우선적으로 발견되는 반면, 사이토칼레스톤과 사이토카네틱 브리지와 같은 다른 미세조절이 풍부한 지역에서도 발견된다. 훈련된 Ai는 이미지에서 섬모를 제대로 식별했지만 다른 비 섬모, 아세틸화된 튜룰린 양성 구조는 식별하지 못했습니다. IMCD 세포의 섬모는 0.5 μm에서 4.5 μm까지, 평균 길이는 1.8± 0.04 μm(그림2A)이었다. 우리는 다음 1 차적인 신경 배양에 있는 섬모 길이를 측정하는 Ai의 기능을 시험했습니다. 우리는 10 일 동안 신생아 마우스의 시상 하부 및 해마에서 뉴런을 배양하고 cilia 마커 adenylate cyclase III (ACIII) III (ACIII)21, 41로그들을 면역 라벨. 신경 배양을 분석할 때, 우리는 통계적으로 길이를 분석하기 전에 필터를 적용하는 것이 유용한다는 것을 것을을 발견했습니다. 신호 대 노이즈 비율이 낮기 때문에 1 μm 미만의 여러 물체가 섬모가 아닌 것으로 확인되었습니다. 따라서 데이터를 필터링하여 길이가 1μm 미만인 물체를 제거하여 섬모만 분석되도록 했습니다. 배양 시상 하 부 뉴런에서, 섬모 길이는 3.8 ± 0.19 μm(그림 2B)의평균 길이와 2 μm에서 7 μm에 구역 수색했다. 흥미롭게도, 배양 해마 뉴런 섬모는 평균 길이 6.73 ±0.15μm(도2C)로더 길어졌다. 시상 하부 내의 다른 뉴런 핵은 별개의 섬모 길이를 나타내며 이러한 섬모가 핵 특이적방식(19,23)의생리적 변화에 대응하여 길이를 변경하는 것으로 보고되었다. 따라서, 우리는 또한 ACIII를 가진 성인 남성 C57BL/6J 마우스에서 시상하부 뇌 단면을 표시하고 아크추아테 핵 (ARC) 및 심방 핵 (PVN)을 심화시켰다. CI3를 사용하여 섬모 길이를 측정하기 위해 생체 내 시상 하 부 섬혈이 체외 섬모보다 더 오래 나타났다는 것을 관찰했습니다. 구체적으로, 생체 내의 시상하액 섬모는 1 μm에서 약 15 μm(그림3)까지다양합니다. PVN(5.54 ± 0.0.42 μm)과 ARC(6.16 ± 0.27 μm)의 섬모 길이와ARC(그림 3C)23의섬모 길이 사이에는 큰 차이가 없었다. 유사하게, 해마의 각막 암모니(CA1) 부위내 의 섬모는 평균 길이 5.28± 0.33 μm(그림3)을가진 1 μm에서 10 μm까지 의 좁은 길이 범위를 나타낸다. 이전에 발표된 연구에 따르면 Ai 및 GA3 도구를 사용한 당사의 분석에 따르면 다양한 뇌 영역의 섬모가길이 19,23의다양성을 보이는 것으로 나타났습니다. 또한,이 Ai 접근 방식을 사용하여 우리는 신속하게 섬모의 큰 숫자를 평가 할 수 있습니다. GA3를 사용하여 섬모 조성 측정1차 실륨은 모터 단백질, 인트라티글러 수송 단백질 및 GPCR과 같은 독특한 기능을 수행하기 위해 다양한 유형의 단백질을 활용하는 많은 통로를 위한 신호 허브로, 몇 가지3,24,42,43의이름을 지정합니다. 실륨 내에서 이러한 단백질의 적절 한 수준을 유지 하는 것은 적절 한 기능에 대 한 중요 하 고 종종 세포 컨텍스트 의존 나타납니다. 이러한 단백질의 형광 라벨링은 우리가 그(것)들을 시각화하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라 또한 상대적으로 작은 구획20내의 표지된 단백질의 양을 측정하기 때문에 그들의 강도를 정량화하는 가능하게 했습니다. 따라서, 우리는 성인 남성 마우스의 시상 하부(24)및44의ARC 와 PVN 모두에서 생체 내에서 섬모 GPCR, 멜라닌 농축 호르몬 수용체 1 (MCHR1)의 강도를 결정하기 위해 노력했다. Ai 와 GA3를 사용하여, 우리는 계산되는 개체가 섬모(보충 도 3A)인지확인하기 위해 강도와 함께 MCHR1 양성 섬모의 길이를 측정했다. 우리는 길이가 2 μm 미만인 분석 후 물체를 제거하고 남은 이진 마스크의 강도를 분석했습니다. 흥미롭게도, PVN에서 섬모 MCHR1의 강도가 PVN에서 섬모 MCHR1의 강한 존재를 나타내는 ARC에서보다 훨씬 높다는 것을 발견했습니다(그림 4). 추가 연구는 이러한 신경 회로에서 섬모 MCHR1의 중요성을 결정 하는 데 필요한. 우리는 또한 시상 하 부와 해 마의 기본 배양 뉴런에서 섬모 MCHR1의 강도를 측정. 두 배양으로부터의 섬모는 이종성 뉴런 집단의 존재를 암시하는 MCHR1 강도의 광범위한 분포를 나타내고있다(보충도 2). 따라서 Ai 및 GA3와 같은 정교한 분석 도구를 사용하면 동일한 조직 내 또는 다중 조직 간의 섬모 이질성을 평가할 수 있습니다. 다른 신경 GPCRs 같은 조직의 뉴런 내에서 그들의 국소화에 비슷한 차이 표시 하는 경우 보고 재미 있을 것입니다 그리고이 생리적 변화에 대 한 응답으로 변경 하는 경우. 지역화완전한 화상 필드 내에서 형광 강도를 측정하는 것은 단백질의 인상을 줄 수 있지만, 공간 분포 또는 다른 인근 단백질 및 세포 구조에 근접과 같은 정보를 제공하지 못합니다. 여기서, 각 이진 마스크에 대한 ACIII의 강도에 대하여 MCHR1의 강도를 플로팅하여 ACIII와 ACIII와 MCHR1의 중첩을 측정하였다(도5). 그래프는 대부분의 섬모가 ACIII와 MCHR1 모두에 대해 긍정적이라는 것을 보여 주지만 일부 섬모는 한 채널의 더 강한 표현을 서로 보여줍니다. 또한 각각 x축과 y축에 직접 있는 지점에서 알 수 있듯이 ACIII 또는 MCHR1의 존재를 보여주는 일부 섬모가 있습니다. 이러한 중첩을 정량화하기 위해, 우리는 Mander의 중첩 계수를 측정하고 ARC 및 PVN40의신경 섬모에서 MCHR1 발현의 정도를 비교했습니다. 흥미롭게도, 우리의 분석은 ARC (0.5430 ± 0.0181)(그림 5C)에있는 것보다 PVN (0.6382 ± 0.0151)의 계수에 있는 중요한 증가가 있었다는 것을 밝혔습니다. 이는ARC(그림 4)에비해 PVN에서 MCHR1 강도가 높은 것을 관찰한 이전 데이터와 일치합니다. 이 데이터는 섬모 길이같이, 섬모 구획에 있는 MCHR1의 발현 패턴이 두뇌의 다른 지구에 변화한다는 것을 건의합니다. 동일한 분석 파이프라인을 사용하여, 신경펩타이드 Y 수용체 유형 2(NPY2R) 및 소마토스타틴 수용체 유형 3(SSTR3)와 같은 다른 섬모GPC가 비슷한 양의 다양성을 보이는지 여부를 결정할 수 있을 것이다. 실륨을 따라 강도 프로파일 측정segment.ai 사용하여 섬모가 확인되면 GA3 레시피를 수정하여 섬모 분석을 이미지에 대한 다른 관심 구조를 식별하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 기초 바디 마커로 라벨링은 섬모 극성을 식별하는 데 유용합니다. 이러한 분석을 수행하기 위해, 우리는 ARL13B-mCherry및 Centrin2-GFP를 발현하는 P0 마우스의 시상 하부 뇌 섹션을 이미지화하고 ARC 및 PVN34를이미지화하였다. 여기서, 섬모는 Ai를 이전과 같이 확인했지만, 지금 수정된 GA3 레시피는 섬모의 기지에서 발견되는 센트리올라 단백질인 Centrin2-GFP의 식별을포함한다(보충 도 3B). Centrin2-GFP를 표시함으로써, 섬모의 기초는 ARL13B-mCherry 양성 섬리아(그림 6A)의끝과 구별 될 수있다. 그런 다음, 전체 섬모 내에서 강도를 측정하는 대신, 우리는 섬모의 길이를 따라 ARL13B 강도의 변화를 측정 할 수 있습니다(그림 6B). 우리는 또한 Cilia의 근위 끝과 말단 끝 사이의 ARL13B의 강도의 차이를 비교할 수 있습니다. 이를 위해, 우리는 베이스에서 시작하여 1 미칸 쓰레기통으로 실륨 길이를 분할하고 첫 번째 미크로른 빈을 근위 말단으로 지정하고 마지막 미크로른 빈을 말단 끝으로 지정했습니다. 우리의 분석은 ARC와 PVN 둘 다에 있는 cilium의 끝 보다는 기지에 훨씬 더 많은 ARL13B가 존재한다는 것을 밝혔습니다, 이것은 인간 연골세포(그림 6C)에이전에 간행된 연구 결과와 일치한다는 것을 제시했습니다. 이러한 유형의 분석에서는 작은 비섬모개체를 분석에서 제외하기 위해 길이 필터를 적용하는 대신 Centrin2-GFP 라벨링과 관련된 섬모만 분석됩니다. 이것은 유전 돌연변이가 아주 짧은 섬모를 렌더링하는 상황에서 유리할 수 있습니다, 또는 전환 영역 또는 팁 같이 섬모 하위 도메인에 있는 변경이 연루된 경우에. Ai 및 GA3 분석을 사용하여 섬모를 식별하는 것은 적응력이 뛰어나며 다양한 복잡한 연구 질문에 맞게 조정할 수 있습니다. 그림 1. Ai를 사용하여 섬모 길이와 강도를 측정하기위한 워크플로우. (A)Ai를 훈련시키기 위해, 원시 훈련 이미지에 관심있는 개체 (섬모)주위에 바이너리가 그려집니다. 분할 Ai는 그려진 바이너리를 사용하여 섬모의 모양과 픽셀 강도를 인식하도록 훈련됩니다. (B)다음으로, 훈련된 세그먼트 Ai가 원시 실험 이미지에 적용됩니다. 그것은 섬모로 인식 개체에 바이너리를 그립니다. 이 바이너리는 모든 섬모만 분석되고 있는지 확인하기 위해 정제 될 수 있습니다. (C)GA3 프로그램은 Ai에서 인식하는 물체의 강도와 길이를 분석하기 위해 제작된다. (D)레코드는 소프트웨어의 테이블로 가져옵니다. 그런 다음 이 테이블을 내보내 추가 분석을 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2. 체외 실리아 길이 측정. 섬모의 대표적인 이미지 (A)IMCD 세포 (녹색, 아세틸레이션 튜룰린)(B)1 차 시상 하 계 배양 (녹색, ACIII) 및(C)해마 배양 (녹색, ACIII). 훈련된 Ai는 이진 마스크(magenta)에 도시된 바와 같이 섬모를 인식하는 데 사용되었고 GA3는 섬모 길이를 측정하는 데 사용되었다. 섬모 길이의 분포는 0.5 또는 1.0 미크론 쓰레기통에서 섬모의 백분율로 그래프로 표시됩니다. * Ai가 제대로 인식하지 못하는 사이토카네틱 다리를 나타냅니다. 3개의 복제에서 IMCD 세포에 있는 n=225 섬모, 시상 하부에서 54개의 섬모및 3마리동물에서 해마 배양에 있는 139개의 섬모. 10 μm 의 배율 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3. 생체 내 섬모 길이 측정. (A)성인 마우스 뇌 섹션의 ARC, PVN 및 CA1에서 섬모(녹색, ACIII)의 대표적인 이미지. (B)NIS 엘리먼트에서 훈련된 Ai는 이진 마스크(magenta)에 도시된 바와 같이 섬모를 인식하는 데 사용되었고, 그 후 GA3는 섬모 길이를 측정하는 데 사용되었다. (C)섬모 길이의 분포는 1미크론 쓰레기통에서 섬모의 백분율로 그래프로 표시됩니다. 아크에서 68개의 섬모, PVN에서 36개, CA1에서 29마리가 3마리의 동물입니다. 10 μm 의 배율 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4. Ai는 시상 하 부 신경 섬모의 섬모 염색 강도 측정을 지원. (A)성인 마우스 뇌 섹션의 ARC 및 PVN에서 섬모(MCHR1, red)의 대표적인 이미지. NIS 엘리먼트의 숙련된 Ai는 이진 마스크(시안)에 도시된 바와 같이 섬모를 인식하는 데 사용되었고 GA3는 CIlia에서 염색하는 MCHR1의 강도를 측정하는 데 사용되었습니다. (B)MCHR1 강도는 평균 ± S.E..M 그래프로 표시됩니다. 각 점은 실륨을 나타냅니다. * p < 0.05, 학생의 t 테스트. (C)MCHR1 강도의 분포는 0.2 x 107 임의 단위(A.U.)의 쓰레기통에서 섬모의 백분율로 그래프화됩니다. 아크에서 n = 53 섬모, 3 동물에서 PVN에서 78. 10 μm 의 배율 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5. Ai는 섬모 공동 분석 분석을 지원했습니다. (A, B) 각각 ARC 및 PVN에서 섬모의 대표적인 이미지. Cilia는 ACIII(녹색) 및 MCHR1(빨간색)으로 표시됩니다. NIS 엘리먼트의 훈련된 Ai는 이진 마스크(ACIII 라벨에 표시된 섬모의 마젠타, MCHR1 라벨이 붙은 섬모용 시안)에 표시된 것처럼 섬모를 인식하는 데 사용되었습니다. GA3는 ACIII와 MCHR1을 모두 포함하는 섬모를 인식하는 데 사용되었습니다. (C)Manders 중첩 계수 (MOC) 값은 평균 ± S.E.M 로 그래프화됩니다. 각 점은 실륨을 나타냅니다. * p < 0.05, 학생의 t 테스트. (D)ARC 및 PVN에서 MCHR1 강도 대 ACIII 강도의 분산 플롯. 각 점은 실륨을 나타냅니다. 아크에서 72 개의 섬모, 3 마리의 동물에서 PVN에서 47. 10 μm 의 배율 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6. 섬모와 기초 신체 분석. (A)P0 마우스의 ARC 및 PVN에서 섬모(빨간색, ARL13B-mCherry) 및 기초 체체 마커(녹색, Centrin2-GFP)의 대표적인 이미지. 훈련된 Ai는 이진 마스크(시안)에 도시된 바와 같이 섬모를 인식하는 데 사용되었다. 기초 체체 (마젠타)에 대한 바이너리 마스크는 GA3 레시피의 임계값에 의해 그려졌습니다. (B)주실의 대표 라인 스캔 강도. (C)Ai의 근해 및 단부 끝에서 ARL13B 강도는 평균 ± S.E.M로 그래프를 식별하였다. 근위 및 단부 단말은 실륨의 기저로부터 각각 첫 1 μm 길이 및 마지막 1 μm 길이 내의 영역으로 정의된다. 각 점은 실륨을 나타냅니다. * p < 0.05. n = 3 마리동물로부터 2마리의 동물과 21마리의 섬모에서 ARC에서 6개의 섬모. 10 μm 의 배율 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 1. Ai 훈련 손실 그래프. (A, B)시험관 내 및 생체 내 뉴런 섬모에 대한 segment.ai 훈련 손실을 각각 보여주는 그래프. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 2. Ai 는 체외 신경 섬모의진도 측정을 염색하는 것을 지원했습니다. (A, B) 1 차시 상하 및 해마 배양에서 섬모 (MCHR1, 빨간색)의 대표적인 이미지, 각각. NIS 엘리먼트의 숙련된 Ai는 이진 마스크(시안)에 도시된 바와 같이 섬모를 인식하는 데 사용되었고 GA3는 CIlia에서 염색하는 MCHR1의 강도를 측정하는 데 사용되었습니다. MCHR1 강도의 분포는 시상 하 증에 대 한 1000 A.U. 쓰레기통에 섬모의 백분율로 그래프와 2000 해 마 문화에 대 한 A. U. 쓰레기통. n= 시상 하 증에 있는 30 개의 섬모와 3 마리의 동물로부터 해마 배양에서 106 개의 섬모. 10 μm 의 척도 막대. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 3. 일반 분석 3 섬모 분석을위한 조리법. (A)섬모 길이, 강도 및 맨더계수의 측정을 위한 간단한 일반 분석(GA3) 레시피. (B)기초 체체에 대한 마커를 사용하여 실륨의 길이를 따라 강도를 측정하기 위한 복잡한 GA3 레시피. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.