Birincil Cilia'yı Değerlendirmede Yapay Zeka Yaklaşımları

Cilia’yı tanımlamak için Ai’yi eğitmekCilia yapısal uzunluğunu ve bileşimini ölçmek ve değerlendirmek sıkıcı, zaman alıcı ve hataya eğilimli bir süreç olabilir. Burada, cilia’yı geniş bir görüntü havuzundan doğru bir şekilde segmentlere ayırıp uzunluklarını ve yoğunluklarını bir analiz aracıyla analiz etmek için Ai kullanıyoruz (Şekil 1). Tüm Ai yaklaşımları, uygulamaları için eğitim adımları gerektirir. Siliary yapılara manuel olarak ikili maskeler uygulanarak gerçekleştirilen cilia’yı tanımak için bir eğitim boru hattı kurduk. Bu bilgiler daha sonra uygulanan ikili dosyalar altındaki piksel özelliklerine göre Ai’yi eğitmek için kullanılır. Genel bir kılavuz olarak, eğitim yazılımın yaklaşık 1000 olmak üzere çeşitli yinelemelerden geçmesiyle içerir ve eğitim kaybı veya hata oranı% 1’den azsa en uygun olarak kabul edilir. Ancak, eğitim sürecindeki yinelemelerin ve hataların sayısı, eğitim için kullanılan örnek görüntülere bağlı olarak değişebilir. Örneğin, in vitro nöronal cilia görüntülerini kullanarak yaptığımız eğitim seansları sonrasında in vivo beyin kesiti görüntüleri için hata oranı %3,36 iken %1,378 olarak gerçeklenmiştir ( EkŞekil 1). Eğitim tamamlandıktan sonra, Ai daha sonra deneysel görüntülerden cilia’yı saniyeler içinde segmentlere ayırmak için kullanılabilir ve elde edilen ikili maskeler yapısal parametreleri ölçmek için kullanılır. Bu, yüksek arka plan gürültüsüne sahip görüntülerde veya nesneler birbirine yakın olduğunda zor olabilecek geleneksel yoğunluk eşiği yöntemini kullanarak nesneleri segmentlere ayırma ihtiyacını ortadan kaldırır. Ai ayrıca, kullanıcıdan bağımsız olarak tüm görüntülere aynı algoritmayı uygulayarak hata ve önyargı potansiyelini azaltır. GA3 kullanarak cilia uzunluğunu ölçmeCilia uzunluğu sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve silier sinyal16,19üzerindeki fonksiyonel etkilerle ilişkilidir. Burada, Nis Elements yazılımı içinde Genel Analiz 3 veya GA3 adlı bir analiz ardışık düzeni kullanarak cilia uzunluklarını ölçtük. GA3, her deneme için özelleştirilmiş yordamlar oluşturmak üzere birden fazla aracı tek bir iş akışında birleştirmede yardımcı olur. Bir hücre hattındaki cilia uzunluklarını ölçerek başladık. Fare iç medüller toplama kanalında (IMCD-3) Cilia asetillenmiş tubulin ile immünolabelled ve konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. segment.ai ile segmente ettikten sonra GA3 kullanarak cilia uzunluklarını ölçtük(Ek Şekil 3A). Asetilasyonlu α-tubulin tercihen birincil sesiyumda bulunurken, sitoskeleton gibi diğer mikrotübül zengin bölgelerinde ve sitokintik köprüde de bulunur. Eğitimli Ai, görüntüdeki cilia’yı düzgün bir şekilde tanımladı, ancak diğer siliyer olmayan, asetillenmiş tübulin pozitif yapıları tanımlamadı. IMCD hücrelerinde Cilia, ortalama uzunluğu 1,8 ± 0,04 μm olan 0,5 μm ile 4,5 μm arasında değişmektedir (Şekil 2A). Daha sonra Ai’nin birincil nöronal kültürlerde cilia uzunluklarını ölçme yeteneğini test ettik. Yenidoğan farelerinin hipotalamus ve hipokampusundan nöronları 10 gün boyunca kültürledik ve cilia marker adenilit siklaz III (ACIII)21,41ile immünoplabelled. Nöronal kültürleri analiz ederken, uzunlukları istatistiksel olarak analiz etmeden önce bir filtre uygulamayı yararlı bulduk. Gürültü oranı daha düşük bir sinyal nedeniyle, 1 μm’den daha az cilia olmayan birkaç nesne tanımlanmıştır. Bu nedenle, sadece cilia’nın analiz edildiğinden emin olmak için 1 μm’den daha kısa olan nesneleri ortadan kaldırmak için verileri filtreledik. Kültürlü hipotalamik nöronlarda, cilia uzunlukları ortalama uzunluğu 3,8 ± 0,19 μm olan 2 μm ila 7 μm arasında değişmektedir (Şekil 2B). İlginçtir ki, kültürlü hipokampal nöronal cilia ortalama uzunluğu 6.73 ±0.15μm (Şekil 2C)ile daha uzundu. Hipotalamus içindeki farklı nöronal çekirdeklerin farklı cilia uzunlukları gösterdiği ve bu ciliaların çekirdeğe özgü bir şekilde fizyolojik değişikliklere yanıt olarak uzunluklarını değiştirdiği bildirilmiştir19,23. Bu nedenle, yetişkin erkek C57BL/6J farelerden hipotalamik beyin bölümlerini ACIII ile etiketledik ve arcuate çekirdeğini (ARC) ve paraventriküler çekirdeği (PVN) görüntüledik. Cilia uzunluklarını ölçmek için GA3 kullanarak, in vivo hipotalamik cilia’nın in vitro cilia’dan daha uzun göründüğünü gözlemledik. Özellikle, hipotalamik cilia in vivo 1 μm ila yaklaşık 15 μm arasında değişmektedir (Şekil 3). PVN’deki (5,54 ± 0,0,42 μm) cilia uzunlukları ile ARC’dakiler (6,16 ± 0,27 μm) (Şekil 3C)23arasında anlamlı bir fark yoktu. Benzer şekilde, hipokampus’un cornu ammonis (CA1) bölgesindeki cilia, ortalama uzunluğu 5,28 ± 0,33 μm olan 1 μm ila 10 μm arasında daha dar bir uzunluk aralığı gösterir (Şekil 3). Daha önce yayınlanan çalışmalara uygun olarak, Ai ve GA3 araçlarını kullanarak yaptığımız analizler, farklı beyin bölgelerinden gelen cilia’nın19,23uzunluğunda çeşitlilik gösterdiğini gösterdi. Ayrıca, bu Ai yaklaşımını kullanarak çok sayıda cilia’yı hızla değerlendirebiliyoruz. GA3 kullanarak cilia bileşimini ölçmeBirincil eksiyum, motor proteinleri, intraflageller taşıma proteinleri veGPCR’ler gibi benzersiz işlevleri yerine getirmek için çeşitli proteintürlerini kullanan birçok yol için bir sinyal merkezidir. Bu proteinlerin uygun seviyelerinin sezyum içinde tutulması uygun çalışma için önemlidir ve genellikle hücre bağlamına bağımlı olarak görünür. Bu proteinlerin floresan etiketlemesi sadece onları görselleştirmemizi sağlamakla kalmadı, aynı zamanda nispeten küçük bölmedeki etiketli protein miktarının bir ölçüsü olarak yoğunluklarını da ölçtü20. Bu nedenle, yetişkin erkek farelerin hipotalamusunun hem ARC hem de PVN in vivo’sunda silier GPCR, Melanin Konsantre Hormon Reseptörü 1 (MCHR1) yoğunluklarını belirlemeye çalıştık24,44. Ai ve GA3 kullanarak, sayılan nesnelerin cilia olduğundan emin olmak için yoğunluklarla birlikte MCHR1 pozitif cilia uzunluklarını ölçtük (Ek Şekil 3A). Analiz sonrası 2 μm’den daha kısa olan nesneleri ortadan kaldırdık ve kalan ikili maskelerin yoğunluklarını analiz ettik. İlginçtir ki, PVN’de silier MCHR1 yoğunluğunun ARC’dakinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ve PVN’de silier MCHR1’in daha güçlü bir varlığını gösterdiğini gördük(Şekil 4). Bu nöronal devrelerde siliary MCHR1’in önemini belirlemek için daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Ayrıca hipotalamus ve hipokampüsün birincil kültürlü nöronlarında siliary MCHR1’in yoğunluklarını ölçtük. Her iki kültürden Cilia, heterojen nöronal popülasyonların varlığını düşündüren MCHR1 yoğunluklarının geniş bir dağılımını gösterir (Ek Şekil 2). Bu nedenle, Ai ve GA3 gibi sofistike analitik araçlar kullanmak, aynı doku içinde veya birden fazla doku arasında cilia heterojenliğinin değerlendirilmesini sağlar. Diğer nöronal GPCR’lerin aynı dokunun nöronları içinde lokalizasyonlarında benzer farklılıklar gösterip göstermediğini ve bunun fizyolojik değişikliklere yanıt olarak değişip değişmediğini görmek ilginç olacaktır. KolokalizasyonTam bir görüntü alanı içindeki floresan yoğunluklarını ölçmek protein izlenimi verebilirken, mekansal dağılım veya yakındaki diğer proteinlere ve hücresel yapılara yakınlık gibi bilgileri sağlayamaz. Burada, MCHR1’in yoğunluklarını her ikili maske için ACIII’ninkine göre çizerek bir cilia işaretleyicisi olarak ACIII ile MCHR1’in çakışmasını ölçtük (Şekil 5). Grafik, cilia’nın çoğunluğunun hem ACIII hem de MCHR1 için olumlu olduğunu, ancak bazı ciliaların bir kanalın diğerine göre daha güçlü bir şekilde ifade ettiğini göstermektedir. Ayrıca, sırasıyla doğrudan x ekseni ve y ekseninde yatan noktalardan da görüldüğü gibi ACIII veya MCHR1’in varlığını gösteren bazı cilia vardır. Bu çakışmayı ölçmek için Mander’in örtüşme katsayısını ölçtük ve ARC ve PVN40’ınnöronal cilia’sında MCHR1 ekspresyonunun kapsamını karşılaştırdık. İlginçtir ki, analizimiz PVN katsayılarında (0.6382 ± 0.0151) ARC’dakilere göre önemli bir artış olduğunu ortaya koydu (0.5430 ± 0.0181) (Şekil 5C). Bu, PVN’de ARC’a kıyasla daha yüksek MCHR1 yoğunlukları gözlemlediğimiz önceki verilerimizle tutarlıdır (Şekil 4). Bu veriler, cilia uzunluğu gibi, Siliary kompartımandaki MCHR1’in ifade deseninin beynin farklı bölgelerinde değiştiğini göstermektedir. Aynı analiz boru hattını kullanarak, Nöropeptid Y Reseptör Tip 2 (NPY2R) ve Somatostatin Reseptör Tip 3 (SSTR3) gibi diğer silier GPCR’lerin benzer miktarda çeşitlilik gösterip göstermediğini belirlemek mümkün olacaktır. Esiyum boyunca yoğunluk profilinin ölçülmesiCilia segment.ai kullanılarak tanımlandıktan sonra, GA3 tarifi, cilia analizini görüntüdeki diğer ilgi çekici yapıların tanımlanmasıyla birleştirmek için değiştirilebilir. Örneğin, bazal gövde işaretleyicileri ile etiketleme, cilia polaritesinin tanımlanması için yararlıdır. Bu analizi yapmak için, ARL13B-mCherry ve Centrin2-GFP’yi ifade eden P0 farelerinden hipotalamik beyin bölümlerini görüntüledik ve ARC ve PVN34’ü görüntüledik. Burada, cilia daha önce olduğu gibi Ai kullanılarak tanımlandı, ancak şimdi değiştirilmiş GA3 tarifi, cilia tabanında bulunan centrin2-GFP’nin tanımlanmasını içerir (Ek Şekil 3B). Centrin2-GFP etiketlenerek, cilia tabanı ARL13B-mCherry pozitif cilia ipuçlarından ayırt edilebilir (Şekil 6A). Daha sonra, tüm cilia içindeki yoğunluğu ölçmek yerine, cilia uzunluğu boyunca ARL13B yoğunluğundaki değişiklikleri ölçebiliyoruz (Şekil 6B). Ayrıca, cilia’nın proksimal uçları ve distal uçları arasındaki ARL13B yoğunluğundaki farklılıkları karşılaştırabiliriz. Bunu yapmak için, ekyum uzunluğunu tabandan başlayarak 1 mikronluk kutulara ayırdık ve ilk mikron kutusunu proksimal uç, son mikron kutusunu distal uç olarak belirledik. Analizimiz, tabana hem ARC hem de PVN’deki ssiyumun ucundan önemli ölçüde daha fazla ARL13B bulunduğunu ve bunun insan kondrositleri45’te daha önce yayınlanan çalışmalarla tutarlı olduğunu ortaya koydu (Şekil 6C). Bu tür analizlerde, küçük silier olmayan nesneleri analizden dışlamak için uzunluk filtresi uygulamak yerine, yalnızca Centrin2-GFP etiketlemesiyle ilişkili cilia analiz edilir. Bu, genetik mutasyonların çok kısa cilia yaptığı durumlarda veya geçiş bölgesi veya uç gibi cilia alt etki alanlarındaki değişikliklerin bulaştığı durumlarda avantajlı olabilir. Ai ve GA3 analizi kullanılarak cilia’nın tanımlanması son derece uyarlanabilir ve çeşitli karmaşık araştırma sorularına uyacak şekilde uyarlanabilir. Şekil 1. Ai kullanarak cilia uzunluğunu ve yoğunluğunu ölçmek için iş akışı. (A) Ai’yi eğitmek için ikili dosyalar, ham eğitim görüntüleri üzerinde ilgi çekici nesnelerin (cilia) etrafına çizilir. Çizilen ikili dosyaları kullanarak Segment Ai, cilia’nın şekil ve piksel yoğunluklarını tanımak için eğitilir. (B) Daha sonra, eğitimli Segment Ai ham deneysel görüntülere uygulanır. Cilia olarak tanıdığı nesnelere ikili dosyalar çizer. Bu ikili dosyalar, tüm ve yalnızca cilia’nın analiz edildiğinden emin olmak için geliştirilebilir. (C) Ai tarafından tanınan nesnelerin yoğunluğunu ve uzunluğunu analiz etmek için bir GA3 programı oluşturulur. (D) Kayıtlar yazılımdaki bir tabloya alınır. Bu tablo daha sonra daha fazla analiz için dışa aktarılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2. In vitro cilia uzunluk ölçümleri. Cilia’nın (A)IMCD hücrelerindeki (yeşil, asetillenmiş tubulin) (B) birincil hipotalamik kültürler (yeşil, ACIII) ve (C) hipokampal kültürlerdeki (yeşil, ACIII) temsili görüntüleri. İkili maskede (macenta) gösterildiği gibi cilia’yı tanımak için eğitimli bir Ai kullanıldı ve daha sonra cilia uzunluğunu ölçmek için GA3 kullanıldı. Cilia uzunluğunun dağılımı, 0,5 veya 1,0 mikron kutularda cilia yüzdesi olarak grafiklendirilir. * Sitokintik köprünün Ai tarafından düzgün tanınmadığını gösterir. n=IMCD hücrelerinde 3’ten 225 cilia, hipotalamikte 54 cilia ve hipokampal kültürlerde 3 hayvandan 139 cilia. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3. In vivo cilia uzunluk ölçümleri. (A) Yetişkin fare beyin bölümlerinin ARC, PVN ve CA1’deki cilia (yeşil, ACIII) temsili görüntüleri. (B) nis elemanlarında eğitimli bir Ai, ikili maskede (macenta) gösterildiği gibi cilia’yı tanımak için kullanıldı ve daha sonra cilia uzunluğunu ölçmek için GA3 kullanıldı. (C) Cilia uzunluğunun dağılımı, tek mikronlu kutularda cilia yüzdesi olarak grafiklendirilir. n= ARC’da 68, PVN’de 36 ve CA1’de 3 hayvandan 29. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4. Ai, hipotalamik nöronal cilia’nın cilia boyama yoğunluğu ölçümlerine yardımcı oldu. (A) Yetişkin fare beyin bölümlerinin ARC ve PVN’sinde cilia (MCHR1, kırmızı) temsili görüntüleri. Nis Elementlerinde eğitimli bir Ai, ikili maskede (siyan) gösterildiği gibi cilia’yı tanımak için kullanıldı ve daha sonra cilia’daki MCHR1 lekelemenin yoğunluğunu ölçmek için GA3 kullanıldı. (B) MCHR1 yoğunlukları ortalama ± S.E.M olarak grafiklendirilir. Her nokta bir esiyumu temsil eder. * s < 0.05, Öğrenci t-testi. (C) MCHR1 yoğunluğunun dağılımı, 0,2 x 107 Rasgele Birim (A. U.) kutularında cilia yüzdesi olarak grafiklendirilir. n= ARC’da 53 cilia, 3 hayvandan PVN’de 78. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5. Ai destekli cilia colocalization analizi. (A, B) Sırasıyla ARC ve PVN’deki cilia’nın temsili görüntüleri. Cilia, ACIII (yeşil) ve MCHR1 (kırmızı) ile etiketlenmiştir. NIS Elements’ta eğitimli bir Ai, ikili maskede gösterildiği gibi cilia’yı tanımak için kullanıldı (ACIII için macenta cilia etiketli, MCHR1 için siyan cilia etiketli). GA3, hem ACIII hem de MCHR1 içeren cilia’yı tanımak için kullanıldı. (C) Manders örtünür katsayısı (MOC) değerleri ortalama ± S.E.M olarak grafiklendirilir. Her nokta bir esiyumu temsil eder. * s < 0.05, Öğrenci t-testi. (D) ARC ve PVN’de MCHR1 yoğunluğunun ACIII yoğunluğuna karşı saçılma grafiği. Her nokta bir esiyumu temsil eder. n= ARC’da 72 cilia, 3 hayvandan PVN’de 47. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6. Cilia ve bazal vücut analizi. (A) ARC ve P0 farelerinin PVN’sinde cilia (kırmızı, ARL13B-mCherry) ve bazal gövde işaretleyicisinin (yeşil, Centrin2-GFP) temsili görüntüleri. İkili maskede (siyan) gösterildiği gibi cilia’yı tanımak için eğitimli bir Ai kullanıldı. Bazal gövde (macenta) için ikili maske GA3 tarifinde eşik yapılarak çizilmiştir. (B) Bir sezyumun temsili hat tarama yoğunluğu. (C) Ai’nin proksimal ve distal uçlarında ARL13B yoğunlukları, S.E.M ortalama ± olarak grafiklenmiş cilia’yı tanımladı. Proksimal ve distal uçlar, silyumun tabanından sırasıyla ilk 1 μm uzunluk ve son 1 μm uzunluk içindeki bölge olarak tanımlanır. Her nokta bir esiyumu temsil eder. * s < 0.05. n = 2 hayvandan ARC'da 6 cilia ve 3 hayvandan PVN'de 21 cilia. Ölçek çubukları 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tamamlayıcı Şekil 1. Ai eğitim kaybı grafikleri. (A, B) Sırasıyla nöronal cilia in vitro ve in vivo üzerinde segment.ai eğitim kaybını gösteren grafikler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Tamamlayıcı Şekil 2. Ai Yardımcı Cilia in vitro nöronal ciliaboyama yoğunluğu ölçümleri . (A, B) Birincil hipotalamik ve hipokampal kültürlerde sırasıyla cilia (MCHR1, kırmızı) temsili görüntüleri. Nis Elementlerinde eğitimli bir Ai, ikili maskede (siyan) gösterildiği gibi cilia’yı tanımak için kullanıldı ve daha sonra cilia’daki MCHR1 lekelemenin yoğunluğunu ölçmek için GA3 kullanıldı. MCHR1 yoğunluğunun dağılımı hipotalamik için 1000 A.U. kutularında ve hipokampal kültürler için 2000 A. U. kutularında cilia yüzdesi olarak grafiklenmiştir. n= Hipotalamikte 30 cilia ve 3 hayvandan hipokampal kültürlerde 106 cilia. Ölçek çubukları 10 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tamamlayıcı Şekil 3. Cilia analizi için Genel Analiz 3 tarifleri. (A) Cilia uzunluğu, yoğunluğu ve Mander katsayısının ölçümü için Basit Genel Analiz (GA3) tarifi. (B) Bazal gövde için bir işaretleyici kullanarak sicim uzunluğu boyunca yoğunluğun ölçümü için karmaşık GA3 tarifi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.