Künstliche Intelligenz Ansätze zur Beurteilung primärer Zilien

Training Ai zur Identifizierung von ZilienDas Messen und Bewerten der Strukturlänge und -zusammensetzung von Zilien kann ein langwieriger, zeitaufwendiger und fehleranfälliger Prozess sein. Hier verwenden wir Ai, um Zilien aus einem großen Pool von Bildern genau zu segmentieren und ihre Längen und Intensitäten mit einem Analysewerkzeug zu analysieren (Abbildung 1). Alle KI-Ansätze erfordern Trainingsschritte für ihre Umsetzung. Wir haben eine Trainingspipeline zur Erkennung von Zilien eingerichtet, die durch manuelles Auftragen von Binäre masken auf Ziliarstrukturen durchgeführt wurde. Diese Informationen werden dann verwendet, um die Ai basierend auf Pixeleigenschaften unter den angewendeten Binärdateien zu trainieren. Als allgemeine Richtlinie gilt, dass die Software mehrere Iterationen, etwa 1000, durchläuft und als optimal angesehen wird, wenn die Trainingsverlust- oder Fehlerrate weniger als 1% beträgt. Die Anzahl der Iterationen und Fehler im Trainingsprozess kann jedoch je nach den für das Training verwendeten Beispielbildern variieren. Zum Beispiel betrug die Fehlerquote nach unseren Trainingseinheiten mit in vitro neuronalen Zilienbildern 1,378% im Vergleich zu 3,36% für in vivo Gehirnschnittbilder ( ergänzendeAbbildung 1). Sobald das Training abgeschlossen ist, kann Ai verwendet werden, um Zilien aus experimentellen Bildern innerhalb von Sekunden zu segmentieren, und die resultierenden binären Masken werden zur Messung von Strukturparametern verwendet. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, Objekte mit der traditionellen Methode der Intensitätsschwellenwerte zu segmentieren, was in Bildern mit hohem Hintergrundrauschen oder wenn sich Objekte in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, schwierig sein kann. Ai reduziert auch das Potenzial für Fehler und Verzerrungen, indem es den gleichen Algorithmus auf alle Bilder anwendet, unabhängig vom Benutzer. Messung der Zilienlänge mit GA3Die Zilienlänge ist streng reguliert und mit funktionellen Auswirkungen auf die Ziliarsignalisierung verbunden16,19. Hier haben wir Zilienlängen mit einer Analysepipeline innerhalb der NIS Elements-Software namens General Analysis 3 oder GA3 gemessen. GA3 hilft bei der Kombination mehrerer Tools in einem einzigen Workflow, um benutzerdefinierte Routinen für jedes Experiment zu erstellen. Wir begannen mit der Messung der Zilienlängen in einer Zelllinie. Zilien an Zellen des inneren medullären Sammelgangs (IMCD-3) der Maus wurden mit acetyliertem Tubulin immunmarkiert und mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Wir haben Zilienlängen mit GA3 gemessen, nachdem wir mit segment.ai segmentiert wurden (Ergänzende Abbildung 3A). Während acetyliertes α-Tubulin bevorzugt im primären Cilium vorkommt, kommt es auch in anderen mikrotubulireichen Regionen wie dem Zytoskelett sowie der zytokinetischen Brücke vor. Die trainierte Ai identifizierte Zilien im Bild richtig, aber keine anderen nicht-ziliarischen, acetylierten Tubulin-positiven Strukturen. Zilien auf IMCD-Zellen reichten von 0,5 μm bis 4,5 μm mit einer durchschnittlichen Länge von 1,8 ± 0,04 μm (Abbildung 2A). Als nächstes testeten wir die Fähigkeit von Ai, Zilienlängen in primären neuronalen Kulturen zu messen. Wir kultivierten Neuronen aus dem Hypothalamus und Hippocampus von neonatalen Mäusen für 10 Tage und immunomarkierten sie mit dem Zilienmarker Adenylatcyclase III (ACIII)21,41. Bei der Analyse neuronaler Kulturen fanden wir es nützlich, vor der statistischen Analyse der Längen einen Filter anzuwenden. Aufgrund eines geringeren Signal-Rausch-Verhältnisses wurden mehrere Objekte unter 1 μm identifiziert, die keine Zilien waren. Daher haben wir die Daten gefiltert, um Objekte mit einer Länge von weniger als 1 μm zu eliminieren, um sicherzustellen, dass nur Zilien analysiert wurden. In kultivierten hypothalamischen Neuronen lagen die Zilienlängen zwischen 2 μm und 7 μm mit einer durchschnittlichen Länge von 3,8 ± 0,19 μm (Abbildung 2B). Interessanterweise waren kultivierte hippokampale neuronale Zilien mit einer mittleren Länge von 6,73 ±0,15 μm länger (Abbildung 2C). Es wurde berichtet, dass verschiedene neuronale Kerne innerhalb des Hypothalamus unterschiedliche Zilienlängen aufweisen und dass diese Zilien ihre Länge als Reaktion auf physiologische Veränderungen in einer kernspezifischen Weise verändern19,23. Daher markierten wir auch hypothalamische Hirnschnitte von erwachsenen männlichen C57BL/6J-Mäusen mit ACIII und bildeten den Bogenkern (ARC) und den paraventrikulären Kern (PVN) ab. Mit GA3 zur Messung der Zilienlängen beobachteten wir, dass die hypothalamischen Zilien in vivo länger auftraten als die In-vitro-Zilien. Insbesondere hypothalamische Zilien in vivo reichen von 1 μm bis etwa 15 μm (Abbildung 3). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Längen der Zilien im PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) und denen im ARC (6,16 ± 0,27 μm) (Abbildung 3C)23. In ähnlicher Weise weisen Zilien im Cornu Ammonis (CA1)-Bereich des Hippocampus einen engeren Längenbereich von 1 μm bis 10 μm mit einer durchschnittlichen Länge von 5,28 ± 0,33 μm auf (Abbildung 3). In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Studien zeigte unsere Analyse mit Ai- und GA3-Tools, dass Zilien aus verschiedenen Hirnregionen eine Vielfalt in der Längeaufweisen 19,23. Darüber hinaus sind wir mit diesem Ai-Ansatz in der Lage, eine große Anzahl von Zilien schnell zu beurteilen. Messung der Zilienzusammensetzung mit GA3Das primäre Cilium ist ein Signalknotenpunkt für viele Signalwege, die verschiedene Arten von Proteinen nutzen, um einzigartige Funktionen wie Motorproteine, intraflagellare Transportproteine und GPCRs auszuführen, um nur einige zu nennen3,24,42,43. Die Aufrechterhaltung der entsprechenden Konzentrationen dieser Proteine im Cilium ist wichtig für das reibungslose Funktionieren und scheint oft vom Zellkontext abhängig zu sein. Die fluoreszierende Markierung dieser Proteine hat es uns nicht nur ermöglicht, sie zu visualisieren, sondern auch ihre Intensitäten als Maß für die Menge des markierten Proteins innerhalb des relativ kleinen Kompartiments20zu quantifizieren. Daher versuchten wir, die Intensitäten eines ziliaren GPCR, Melanin Concentrating Hormone Receptor 1 (MCHR1), in vivo sowohl im ARC als auch im PVN des Hypothalamus erwachsener männlicher Mäuse zu bestimmen24,44. Mit Ai und GA3 haben wir die Längen von MCHR1-positiven Zilien zusammen mit Intensitäten gemessen, um sicherzustellen, dass die gezählten Objekte Zilien waren (Ergänzende Abbildung 3A). Wir eliminierten Objekte nach der Analyse, die weniger als 2 μm lang waren, und analysierten die Intensitäten der verbleibenden binären Masken. Interessanterweise fanden wir heraus, dass die Intensität von Ziliar-MCHR1 in PVN signifikant höher ist als die in ARC, was auf eine stärkere Präsenz von Ziliar-MCHR1 in PVN hinweist (Abbildung 4). Weitere Studien sind erforderlich, um die Bedeutung von Ziliar-MCHR1 in diesen neuronalen Schaltkreisen zu bestimmen. Wir haben auch die Intensitäten von Ziliar-MCHR1 in primär kultivierten Neuronen von Hypothalamus und Hippocampus gemessen. Zilien aus beiden Kulturen zeigen eine breite Verteilung von MCHR1-Intensitäten, was auf das Vorhandensein heterogener neuronaler Populationen hindeutet (Ergänzende Abbildung 2). So ermöglicht der Einsatz ausgefeilter Analysewerkzeuge wie Ai und GA3 die Bewertung der Zilienheterogenität innerhalb desselben Gewebes oder zwischen mehreren Geweben. Es wird interessant sein zu sehen, ob andere neuronale GPCRs ähnliche Unterschiede in ihrer Lokalisation innerhalb von Neuronen desselben Gewebes zeigen und ob sich dies als Reaktion auf physiologische Veränderungen ändert. KolokalisierungWährend die Messung der Fluoreszenzintensitäten innerhalb eines vollständigen Bildfeldes einen Eindruck von Protein vermitteln kann, liefert sie keine Informationen wie die räumliche Verteilung oder die Nähe zu anderen nahe gelegenen Proteinen und Zellstrukturen. Hier haben wir die Überlappung von MCHR1 mit ACIII als Zilienmarker gemessen, indem wir die Intensitäten von MCHR1 gegen die von ACIII für jede binäre Maske aufgetragen haben (Abbildung 5). Die Grafik zeigt, dass die Mehrheit der Zilien sowohl für ACIII als auch für MCHR1 positiv ist, obwohl einige Zilien eine stärkere Expression eines Kanals gegenüber dem anderen zeigen. Darüber hinaus gibt es einige Zilien, die das Vorhandensein von ACIII oder MCHR1 zeigen, wie aus den Punkten hervorgeht, die direkt auf der x-Achse bzw. der y-Achse liegen. Um diese Überlappung zu quantifizieren, haben wir manders Überlappungskoeffizienten gemessen und das Ausmaß der MCHR1-Expression in neuronalen Zilien der ARC und PVN40verglichen. Interessanterweise ergab unsere Analyse, dass es einen signifikanten Anstieg der Koeffizienten des PVN (0,6382 ± 0,0151) als im ARC (0,5430 ± 0,0181) gab (Abbildung 5C). Dies steht im Einklang mit unseren früheren Daten, bei denen wir höhere MCHR1-Intensitäten in PVN im Vergleich zu ARC beobachtet haben (Abbildung 4). Diese Daten deuten darauf hin, dass das Expressionsmuster von MCHR1 im Ziliarkompartiment wie die Zilienlänge in verschiedenen Regionen des Gehirns variiert. Mit der gleichen Analysepipeline wird es möglich sein zu bestimmen, ob andere ziliarische GPCRs wie Neuropeptid-Y-Rezeptor Typ 2 (NPY2R) und Somatostatin-Rezeptor Typ 3 (SSTR3) eine ähnliche Diversität aufweisen. Messung des Intensitätsprofils entlang des ZiliumsSobald Zilien mit segment.ai identifiziert wurden, kann das GA3-Rezept modifiziert werden, um die Zilienanalyse mit der Identifizierung anderer Strukturen von Interesse im Bild zu kombinieren. Zum Beispiel ist die Markierung mit Basalmarkern nützlich, um die Polarität der Zilien zu identifizieren. Um diese Analyse durchzuführen, haben wir hypothalamische Hirnschnitte von P0-Mäusen abgebildet, die ARL13B-mCherry und Centrin2-GFP exprimieren, und die ARC und PVN34 abgebildet. Hier wurden Zilien wie zuvor mit Ai identifiziert, aber jetzt beinhaltet das modifizierte GA3-Rezept die Identifizierung von Centrin2-GFP, einem zentriolaren Protein, das an der Basis von Zilien gefunden wird (Ergänzende Abbildung 3B). Durch die Kennzeichnung Von Centrin2-GFP kann die Basis der Zilien von den Spitzen der ARL13B-mCherry positiven Zilien unterschieden werden (Abbildung 6A). Anstatt dann die Intensität innerhalb der gesamten Zilien zu messen, können wir Änderungen der ARL13B-Intensität entlang der Länge der Zilien messen (Abbildung 6B). Wir können auch Unterschiede in der Intensität von ARL13B zwischen den proximalen Enden und distalen Enden der Zilien vergleichen. Um dies zu tun, haben wir die Ciliumlänge in 1-Mikron-Behälter ausgehend von der Basis aufgeteilt und den ersten Mikron-Behälter als proximales Ende und den letzten Mikrometer-Behälter als distales Ende bezeichnet. Unsere Analyse ergab, dass sowohl in ARC als auch in PVN signifikant mehr ARL13B näher an der Basis als an der Spitze des Ciliums vorhanden ist, und dies stimmt mit zuvor veröffentlichten Studien an menschlichen Chondrozytenüberein 45 (Abbildung 6C). Anstatt bei dieser Art der Analyse einen Längenfilter anzuwenden, um kleine nicht-ziliarische Objekte von der Analyse auszuschließen, werden nur Zilien analysiert, die mit der Centrin2-GFP-Markierung verbunden sind. Dies kann in Situationen von Vorteil sein, in denen genetische Mutationen sehr kurze Zilien verursachen oder wenn Veränderungen in Zilien-Subdomänen wie der Übergangszone oder der Spitze beteiligt sind. Die Identifizierung von Zilien mittels Ai- und GA3-Analyse ist in hohem Maße anpassungsfähig und kann auf eine Vielzahl komplexer Forschungsfragen zugeschnitten werden. Abbildung 1. Workflow zur Messung von Zilienlänge und -intensität mit Ai. (A) Um die AI zu trainieren, werden Binärdateien um die Objekte von Interesse (Zilien) auf den rohen Trainingsbildern gezeichnet. Anhand der gezeichneten Binärdateien wird Segment Ai darauf trainiert, die Form und Pixelintensität der Zilien zu erkennen. (B) Als nächstes wird das trainierte Segment Ai auf experimentelle Rohbilder angewendet. Es zeichnet Binärdateien auf Objekte, die es als Zilien erkennt. Diese Binärdateien können verfeinert werden, um sicherzustellen, dass alle und nur Zilien analysiert werden. (C) Ein GA3-Programm ist konstruiert, um die Intensität und Länge von Objekten zu analysieren, die von der Ai erkannt werden. (D) Die Datensätze werden in eine Tabelle in der Software importiert. Diese Tabelle kann dann zur weiteren Analyse exportiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2.  In-vitro-Zilienlängenmessungen. Repräsentative Abbildungen von Zilien in (A) IMCD-Zellen (grünes, acetyliertes Tubulin) (B) primäre hypothalamische Kulturen (grün, ACIII) und (C) Hippocampuskulturen (grün, ACIII). Ein trainiertes Ai wurde verwendet, um Zilien zu erkennen, wie in der binären Maske (Magenta) gezeigt, und dann wurde GA3 verwendet, um die Zilienlänge zu messen. Die Verteilung der Zilienlänge wird als Prozentsatz der Zilien in 0,5- oder 1,0-Mikron-Behältern dargestellt. * zeigt eine zytokinetische Brücke an, die von Ai nicht richtig erkannt wird. n=225 Zilien in IMCD-Zellen aus 3 Replikaten, 54 Zilien in Hypothalamus und 139 Zilien in Hippocampuskulturen aus 3 Tieren. Maßstabsbalken 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3. In vivo Zilienlängenmessungen. (A) Repräsentative Bilder von Zilien (grün, ACIII) in der ARC, PVN und CA1 von erwachsenen Maushirnschnitten. (B) Ein trainiertes Ai in NIS-Elementen wurde verwendet, um Zilien zu erkennen, wie in der binären Maske (Magenta) gezeigt, und dann wurde GA3 verwendet, um die Zilienlänge zu messen. (C) Die Verteilung der Zilienlänge wird als Prozentsatz der Zilien in Ein-Mikron-Behältern dargestellt. n= 68 Zilien in ARC, 36 in PVN und 29 in CA1 von 3 Tieren. Maßstabsbalken 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4. Ai-gestützte Zilienfärbung Intensitätsmessungen von hypothalamischen neuronalen Zilien. (A) Repräsentative Bilder von Zilien (MCHR1, rot) in der ARC und PVN von erwachsenen Maushirnschnitten. Ein trainiertes Ai in NIS-Elementen wurde verwendet, um Zilien zu erkennen, wie in der binären Maske (Cyan) gezeigt, und dann wurde GA3 verwendet, um die Intensität der MCHR1-Färbung in Zilien zu messen. (B) McHR1-Intensitäten werden als Durchschnitt ± S.E.M dargestellt. Jeder Punkt stellt ein Cilium dar. * p < 0,05, Student's t-test. (C) Die Verteilung der MCHR1-Intensität wird als Prozentsatz der Zilien in Behältern von 0,2 x 107 beliebigen Einheiten (A. U.) dargestellt. n= 53 Zilien in ARC, 78 in PVN von 3 Tieren. Maßstabsbalken 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5. Ai-gestützte Zilien-Kolokalisationsanalyse. (A, B) Repräsentative Bilder von Zilien im ARC bzw. PVN. Zilien sind mit ACIII (grün) und MCHR1 (rot) gekennzeichnet. Ein trainiertes Ai in NIS-Elementen wurde verwendet, um Zilien zu erkennen, wie in der binären Maske gezeigt (Magenta für ACIII-markierte Zilien, Cyan für MCHR1 markierte Zilien). GA3 wurde verwendet, um Zilien zu erkennen, die sowohl ACIII als auch MCHR1 enthielten. (C) Die MoC-Werte (Manders Overlap Coefficient) werden als Durchschnitt ± S.E.M dargestellt. Jeder Punkt stellt ein Cilium dar. * p < 0,05, Student's t-test. (D) Streudiagramm der MCHR1-Intensität vs. ACIII-Intensität in ARC und PVN. Jeder Punkt stellt ein Cilium dar. n= 72 Zilien in ARC, 47 in PVN von 3 Tieren. Maßstabsbalken 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6. Zilien- und Basalanalyse. (A) Repräsentative Bilder von Zilien (rot, ARL13B-mCherry) und Basalmarker (grün, Centrin2-GFP) in der ARC und PVN von P0-Mäusen. Ein trainiertes Ai wurde verwendet, um Zilien zu erkennen, wie in der binären Maske (Cyan) gezeigt. Die binäre Maske für Basalkörper (Magenta) wurde durch Thresholding im GA3-Rezept gezeichnet. (B) Repräsentative Zeilenscanintensität eines Ciliums. (C) ARL13B-Intensitäten an den proximalen und distalen Enden von Ai identifizierten Zilien, die als durchschnittliche ± S.E.M dargestellt wurden. Die proximalen und distalen Enden sind definiert als die Region innerhalb der ersten 1 μm Länge bzw. der letzten 1 μm Länge von der Basis des Ciliums. Jeder Punkt stellt ein Cilium dar. * S. < 0,05. n = 6 Zilien in ARC von 2 Tieren und 21 Zilien in PVN von 3 Tieren. Maßstabsbalken 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Abbildung 1. Ai-Trainingsverlustdiagramme. (A, B) Graphiken, die den Trainingsverlust von segment.ai auf neuronale zilien in vitro bzw. in vivo zeigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 2. Ai Assisted Cilia Staining Intensität Messungen von in vitro neuronalen Zilien. (A, B) Repräsentative Bilder von Zilien (MCHR1, rot) in primären Hypothalamus- bzw. Hippocampuskulturen. Ein trainiertes Ai in NIS-Elementen wurde verwendet, um Zilien zu erkennen, wie in der binären Maske (Cyan) gezeigt, und dann wurde GA3 verwendet, um die Intensität der MCHR1-Färbung in Zilien zu messen. Die Verteilung der MCHR1-Intensität wird als Prozentsatz der Zilien in 1000 A.E. Behältern für Hypothalamus- und 2000 A. U. Behältern für Hippocampuskulturen grafisch dargestellt. n= 30 Zilien in Hypothalamus und 106 Zilien in Hippocampuskulturen von 3 Tieren. Maßstabsbalken 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 3. Allgemeine Analyse 3 Rezepte für die Zilienanalyse. (A) Einfache allgemeine Analyse (GA3) Rezept zur Messung der Zilienlänge, -intensität und des Mander-Koeffizienten. (B) Komplexe GA3-Rezeptur zur Messung der Intensität entlang der Länge des Ciliums unter Verwendung eines Markers für den Basalkörper. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.