评估原发性纤毛的人工智能方法

训练 Ai 识别纤毛测量和评估纤毛结构长度和组成可能是一个繁琐、耗时且容易出错的过程。在这里，我们使用Ai从大量图像中准确分割纤毛，并使用分析工具分析其长度和强度（图1）。所有Ai方法都需要训练步骤才能实现。我们建立了一个训练管道来识别纤毛，这是通过在纤毛结构上手动应用二进制掩码来执行的。然后，此信息用于根据所应用的二进制文件下的像素特征训练 Ai。作为一般准则，训练涉及软件经历几次迭代，大约1000次，如果训练损失或错误率小于1%，则认为是最佳的。但是，训练过程中的迭代次数和错误次数可能会有所不同，具体取决于用于训练的示例图像。例如，在使用 体外 神经元纤毛图像进行训练后，错误率为1.378%，而 体内 脑切片图像的错误率为3.36%（补充图1）。训练完成后，Ai就可以在几秒钟内从实验图像中分割纤毛，并将产生的二进制掩模用于测量结构参数。这消除了使用传统的强度阈值方法分割物体的需要，这在具有高背景噪声的图像中或当物体彼此靠近时可能很困难。Ai还通过在所有图像上应用相同的算法来减少错误和偏差的可能性，而不管用户是谁。 使用 GA3 测量纤毛长度纤毛长度受到严格调节，与纤毛信号传导的功能影响有关16，19。在这里，我们使用NIS Elements软件中称为General Analysis 3或GA3的分析管道测量纤毛长度。GA3 有助于在单个工作流程中组合多个工具，为每个实验构建自定义例程。我们从测量细胞系中的纤毛长度开始。小鼠髓内收集管（IMCD-3）细胞上的纤毛用乙酰化微管蛋白免疫标记并使用共聚焦显微镜成像。我们在用 segment.ai 分割后使用GA3测量纤毛长度（补充图3A）。虽然乙酰化的α微管蛋白优先存在于原代纤毛中，但它也存在于其他富含微管的区域，如细胞骨架以及细胞动力学桥。经过训练的Ai在图像中正确识别纤毛，但未识别其他非睫状，乙酰化小管蛋白阳性结构。IMCD细胞上的纤毛范围为0.5μm至4.5μm，平均长度为1.8±0.04μm（图2A）。接下来，我们测试了Ai在原代神经元培养物中测量纤毛长度的能力。我们从新生小鼠的下丘脑和海马体培养神经元10天，并用纤毛标志物腺苷酸环化酶III（ACIII）21，41对它们进行免疫标记。在分析神经元培养物时，我们发现在统计分析长度之前应用过滤器很有用。由于信噪比较低，因此鉴定出几个小于1μm的物体不是纤毛。因此，我们过滤了数据以消除长度小于1μm的任何物体，以确保仅分析纤毛。在培养的下丘脑神经元中，纤毛长度范围为2μm至7μm，平均长度为3.8±0.19μm（图2B）。有趣的是，培养的海马神经元纤毛较长，平均长度为6.73±0.15μm（图2C）。据报道，下丘脑内的不同神经元核显示出不同的纤毛长度，并且这些纤毛以细胞核特异性方式响应生理变化而改变其长度19，23。因此，我们还用ACIII标记了成年雄性C57BL / 6J小鼠的下丘脑切片，并对弓形核（ARC）和心室旁核（PVN）进行了成像。使用GA3测量纤毛长度，我们观察到体内下丘脑纤毛比体外纤毛出现的时间更长。具体而言，体内下丘脑纤毛的范围为1μm至约15μm（图3）。PVN中的纤毛长度（5.54±0.0.42μm）与ARC中的纤毛长度（6.16±0.27μm）之间没有显着差异（图3C）23。类似地，海马体角膜（CA1）区域的纤毛显示出从1μm到10μm的较窄长度范围，平均长度为5.28±0.33μm（图3）。根据先前发表的研究，我们使用Ai和GA3工具进行的分析表明，来自不同大脑区域的纤毛在长度19，23中显示出多样性。此外，使用这种Ai方法，我们能够快速评估大量的纤毛。 使用GA3测量纤毛成分原发性纤毛是许多途径的信号传导枢纽，它们利用不同类型的蛋白质来执行独特的功能，如运动蛋白，鞭内转运蛋白和GPCR，仅举几例3，24，42，43。在纤毛内保持这些蛋白质的适当水平对于正常运作很重要，并且通常看起来取决于细胞环境。这些蛋白质的荧光标记不仅使我们能够可视化它们，而且还量化它们的强度，作为相对较小的隔室20内标记蛋白质量的量度。因此，我们试图确定睫状体GPCR，黑色素浓缩激素受体1（MCHR1）的强度，在体内的ARC和PVN的成年雄性小鼠的下丘脑24，44。使用Ai和GA3，我们测量了MCHR1阳性纤毛的长度以及强度，以确保计数的物体是纤毛（补充图3A）。我们消除了分析后长度小于2μm的物体，并分析了剩余二进制掩模的强度。有趣的是，我们发现PVN中睫状体MCHR1的强度显着高于ARC中的强度，这表明PVN中纤毛MCHR1的存在更强（图4）。需要进一步的研究来确定睫状体MCHR1在这些神经元回路中的重要性。我们还测量了下丘脑和海马体原代培养神经元中睫状体MCHR1的强度。来自两种培养物的纤毛显示出MCHR1强度的广泛分布，表明存在异质性神经元群体（补充图2）。因此，使用Ai和GA3等复杂的分析工具可以评估同一组织内或多个组织之间的纤毛异质性。看看其他神经元GPCR是否在同一组织的神经元内的定位方面表现出类似的差异，以及这是否响应于生理变化而改变，这将是很有趣的。 共定位虽然测量完整图像场内的荧光强度可以给人以蛋白质的印象，但它无法提供诸如空间分布或与其他附近蛋白质和细胞结构的接近度之类的信息。在这里，我们通过绘制每个二进制掩模的MCHR1强度与ACIII的强度来测量MCHR1与ACIII作为纤毛标志物的重叠（图5）。该图显示，大多数纤毛ACIII和MCHR1均呈阳性，尽管一些纤毛对一个通道的表达比另一个通道更强。此外，有一些纤毛显示ACIII或MCHR1的存在，这从分别位于x轴和y轴上的点可以明显看出。为了量化这种重叠，我们测量了Mander的重叠系数，并比较了ARC和PVN40的神经元纤毛中MCHR1表达的程度。有趣的是，我们的分析显示，PVN的系数（0.6382±0.0151）比ARC中的系数（0.5430±0.0181）显着增加（图5C）。这与我们之前的数据一致，在这些数据中，与ARC相比，我们在PVN中观察到更高的MCHR1强度（图4）。这些数据表明，像纤毛长度一样，MCHR1在睫状体室中的表达模式在大脑的不同区域有所不同。使用相同的分析管道，可以确定其他纤毛GPCR，如神经肽Y受体2型（NPY2R）和生长抑素受体3型（SSTR3）是否显示出相似的多样性。 测量沿纤毛的强度分布一旦使用 segment.ai 鉴定纤毛，就可以修改GA3配方，将纤毛分析与图像中其他感兴趣的结构的鉴定相结合。例如，使用基础体标记进行标记有助于识别纤毛极性。为了进行这项分析，我们对表达ARL13B-mCherry和Centrin2-GFP的P0小鼠的下丘脑切片进行了成像，并对ARC和PVN34进行了成像。在这里，像以前一样使用Ai鉴定纤毛，但现在修改后的GA3配方包括鉴定Centrin2-GFP，一种在纤毛基部发现的中心蛋白（补充图3B）。通过标记Centrin2-GFP，可以将纤毛的基底与ARL13B-mCherry阳性纤毛的尖端区分开来（图6A）。然后，我们不是测量整个纤毛内的强度，而是能够测量沿着纤毛长度的ARL13B强度的变化（图6B）。我们还可以比较纤毛近端和远端之间ARL13B强度的差异。为此，我们将纤毛长度从底部开始划分为1微米箱，并将第一个微米箱指定为近端，最后一个微米箱指定为远端。我们的分析显示，在ARC和PVN中，ARL13B明显多于纤毛尖端，这与先前发表的人类软骨细胞45 的研究一致（图6C）。在这种类型的分析中，不是应用长度过滤器从分析中排除小的非纤毛物体，而是仅分析与Centrin2-GFP标记相关的纤毛。在基因突变导致纤毛非常短的情况下，或者如果涉及纤毛亚结构域（如过渡区或尖端）的变化，这可能是有利的。使用Ai和GA3分析鉴定纤毛具有高度的适应性，可以定制以适应各种复杂的研究问题。 图 1.使用 Ai 测量纤毛长度和强度的工作流程。（A）为了训练Ai，在原始训练图像上感兴趣的对象（纤毛）周围绘制二进制文件。使用绘制的二进制文件，Segment Ai 被训练来识别纤毛的形状和像素强度。（B） 接下来，将经过训练的片段 Ai 应用于原始实验图像。它在它识别为纤毛的对象上绘制二进制文件。可以对这些二进制文件进行细化，以确保分析所有且仅分析纤毛。（C）构建了一个GA3程序来分析Ai识别的物体的强度和长度。（D） 记录被导入到软件中的表中。然后可以导出此表以进行进一步分析。 请点击此处查看此图的放大版本。 图 2.体外纤毛长度测量。纤毛在（A）IMCD细胞（绿色，乙酰化微管蛋白）（B）原代下丘脑培养物（绿色，ACIII）和（C）海马培养物（绿色，ACIII）中的代表性图像。训练有素的Ai用于识别纤毛，如二进制掩模（洋红色）所示，然后使用GA3测量纤毛长度。纤毛长度的分布图为0.5或1.0微米箱中纤毛的百分比。* 表示 Ai 未正确识别细胞动力学桥。来自3个重复的IMCD细胞中的n = 225纤毛，下丘脑细胞中的54个纤毛和来自3只动物的海马培养物中的139个纤毛。比例尺 10 μm.请单击此处查看此图的放大版本。 图 3.体内纤毛长度测量。（A） 成年小鼠大脑切片的 ARC、PVN 和 CA1 中纤毛（绿色、ACIII）的代表性图像。（B）NIS Elements中训练有素的Ai用于识别纤毛，如二进制掩模（洋红色）所示，然后GA3用于测量纤毛长度。（C） 纤毛长度的分布图为一微米箱中纤毛的百分比。n= 68 纤毛在 ARC 中，36 在 PVN 中，29 在 CA1 中，来自 3 只动物。比例尺 10 μm.请单击此处查看此图的放大版本。 图 4.Ai辅助下丘脑神经元纤毛的纤毛染色强度测量。 （A） 成年小鼠大脑部分ARC和PVN中纤毛（MCHR1，红色）的代表性图像。使用NIS Elements中训练有素的Ai来识别纤毛，如二进制掩模（青色）所示，然后使用GA3测量纤毛中MCHR1染色的强度。（B） MCHR1強度被繪成平均±S.E.M。每个点代表一个纤毛。* p < 0.05，学生的 t-检验。（C） MCHR1 强度的分布绘制为 0.2 x 107 任意单位 （A. U.） 的箱子中纤毛的百分比。n = ARC 中的 53 个纤毛，3 只动物的 78 个 PVN。比例尺 10 μm. 请单击此处查看此图的放大版本。 图 5.Ai辅助纤毛共定位分析。 （A， B）分别是 ARC 和 PVN 中纤毛的代表性图像。纤毛被标记为ACIII（绿色）和MCHR1（红色）。在NIS Elements中训练有素的Ai用于识别纤毛，如二进制面罩所示（洋红色表示ACIII标记纤毛，青色表示MCHR1标记纤毛）。GA3用于识别同时含有ACIII和MCHR1的纤毛。（C） 曼德重叠系数 （MOC） 值绘制为 S.E.M ±平均值。每个点代表一个纤毛。* p < 0.05，学生的 t-检验。（D） ARC 和 PVN 中 MCHR1 强度与 ACIII 强度的散点图。每个点代表一个纤毛。n = ARC 中的纤毛为 72，PVN 为 47，来自 3 只动物。比例尺 10 μm. 请单击此处查看此图的放大版本。 图 6.纤毛和基底体分析。（A） P0 小鼠 ARC 和 PVN 中纤毛（红色，ARL13B-mCherry）和基底体标记（绿色，Centrin2-GFP）的代表性图像。训练有素的Ai被用来识别纤毛，如二进制面具（青色）所示。基底体（洋红色）的二进制掩模是通过GA3配方中的阈值绘制的。（B） 纤毛的代表性线阵扫描强度。（C） Ai鉴定出的纤毛近端和远端的ARL13B强度为S.E.M±平均值。近端和远端分别定义为距纤毛基部前1μm长度和最后1μm长度的区域。每个点代表一个纤毛。* p < 0.05。n = 2 只动物的 ARC 中的 6 个纤毛和 3 只动物的 PVN 中的 21 个纤毛。比例尺 10 μm. 请单击此处查看此图的放大版本。 补充图1。AI 训练损失图。 （A， B） 分别显示神经元纤毛 在体外 和 体内 的 segment.ai 训练损失的图。 请点击此处下载此文件。 附图2。Ai辅助纤毛染色强度测量 体外 神经元纤毛。（A， B）原发性下丘脑培养物和海马培养物中纤毛（MCHR1，红色）的代表性图像。使用NIS Elements中训练有素的Ai来识别纤毛，如二进制掩模（青色）所示，然后使用GA3测量纤毛中MCHR1染色的强度。MCHR1强度的分布图为下丘脑培养物的1000 A.U.箱和海马培养物的2000 A.U.箱中纤毛的百分比。n= 3 只动物的下丘脑为 30 只纤毛，海马培养物为 106 只纤毛。比例尺 10 μm. 请点击这里下载此文件。 补充图3。一般分析 纤毛分析的3个食谱。 （A） 用于测量纤毛长度、强度和曼德系数的简单一般分析 （GA3） 配方。（B） 复杂的GA3配方，用于使用基底体的标记物测量沿着纤毛长度的强度。 请点击此处下载此文件。