JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Biochimica

Os gasodutos automatizados de cristalização no embl HTX Facility em Grenoble

Published: June 05, 2021
doi:
10.3791/62491
, , , , , , , , , ,
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

Aqui, descrevemos como usar os dutos de cristalografia macromolecular automatizados para análises de proteínas para estrutura, análise rápida do complexo ligante-proteína e triagem de fragmentos em larga escala com base na tecnologia CrystalDirect no Laboratório HTX em EMBL Grenoble.

Abstract

A EMBL Grenoble opera o High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), uma instalação de usuário em larga escala que oferece serviços de cristalografia de alto rendimento para usuários em todo o mundo. O laboratório HTX tem um forte foco no desenvolvimento de novos métodos na cristalografia macromolecular. Através da combinação de uma plataforma de cristalização de alto rendimento, a tecnologia CrystalDirect para montagem e criocoolização de cristais totalmente automatizadas e o software CRIMS desenvolvemos pipelines totalmente automatizados para cristalografia macromolecular que podem ser operados remotamente pela internet. Estes incluem um pipeline de proteína para estrutura para a determinação de novas estruturas, um pipeline para a caracterização rápida de complexos de ligantes proteicos em apoio à química medicinal, e um pipeline de triagem de fragmentos automatizado em larga escala permitindo a avaliação de bibliotecas de mais de 1000 fragmentos. Aqui descrevemos como acessar e usar esses recursos.

Introduction

A automação foi introduzida em todas as etapas do processo experimental de cristalografia macromolecular, desde a cristalização até a coleta e processamento de dados de difração1,2,3,4,5,6,7,8,9, incluindo uma série de tecnologias para montagem amostral10,11,12 ,13,14,15,16,17. Isso não só acelerou o ritmo em que as estruturas cristalográficas são obtidas, mas contribuiu para simplificar aplicações como o projeto de medicamentos guiados por estrutura18,19,20,21,22,23,24. Neste manuscrito descrevemos alguns dos aspectos dos gasodutos de cristalização automatizados disponíveis no laboratório HTX em Grenoble, bem como as tecnologias subjacentes.

O laboratório HTX da EMBL Grenoble é uma das maiores instalações acadêmicas para triagem de cristalização na Europa. É co-localizada no campus europeu de Fóton e Nêutron (EPN) em conjunto com o European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), que produz alguns dos mais brilhantes raios-X do mundo e o Institut Laue Langevin (III), que fornece feixes de nêutrons de alto fluxo. Desde o início das operações, em 2003, o laboratório HTX forneceu serviços para mais de 800 cientistas e processa mais de 1000 amostras por ano. O laboratório HTX tem um forte foco no desenvolvimento de novos métodos na cristalografia macromolecular, incluindo métodos para avaliação de amostras e controle de qualidade25,26 e a tecnologia CrystalDirect, permitindo a montagem e processamento de cristais totalmente automatizados15,16,17. O laboratório HTX também desenvolveu o Crystallographic Information Management System (CRIMS), um sistema de informações laboratoriais baseado na Web que fornece comunicação automatizada entre instalações de cristalização e coleta de dados síncrotrons, permitindo o fluxo de informações ininterruptas durante todo o ciclo amostral, desde proteína pura até dados de difração. Através da combinação das capacidades da instalação HTX, da tecnologia CrystalDirect e do software CRIMS, desenvolvemos dutos de proteína totalmente automatizados integrando triagem de cristalização, otimização de cristais, processamento automatizado de coleta de cristais e coleta de dados de criocooling e raios-X em múltiplos síncrotrons em um fluxo de trabalho único e contínuo que pode ser operado remotamente através de um navegador web. Esses gasodutos podem ser aplicados para apoiar a rápida determinação de novas estruturas, a caracterização de complexos de ligantes proteicos e triagem composta e fragmentada em larga escala através da cristalografia de raios-X.

O laboratório HTX é equipado com um robô de cristalização não volume (incluindo um módulo LCP que permite a cristalização de proteínas solúveis e membranas), fazendas de cristal (a 5 °C e 20 °C), duas estações robóticas de manuseio líquido para preparar telas de cristalização e duas colheitadeiras de cristal cristalizadas automatizadas com capacidade para produzir e armazenar até 400 pinos de amostra congelados por ciclo de operação. Os cientistas enviam suas amostras para a instalação pelo express courier, que são então processados por técnicos dedicados no laboratório HTX. Os cientistas podem projetar remotamente experimentos de triagem e otimização de cristalização através de uma interface web fornecida pelo sistema CRIMS. Através desta interface, eles podem escolher entre uma ampla gama de parâmetros e protocolos experimentais disponíveis na instalação para se adequar aos seus requisitos específicos de amostra. Os resultados em conjunto com todos os parâmetros experimentais são disponibilizados aos usuários em tempo real através do CRIMS. Todas as amostras recebidas são avaliadas através de um método especificamente desenvolvido que permite estimar a probabilidade de cristalização da amostra25,26,27. Com base nos resultados deste ensaio, recomendações específicas são feitas aos usuários sobre a temperatura ideal de incubação e possíveis experimentos de otimização da amostra. Uma vez que os experimentos de cristalização são configurados, o cientista pode avaliar os resultados olhando para imagens de cristalização coletadas em diferentes pontos de tempo através da web. Quando cristais adequados para experimentos de difração de raios-X são identificados, os cientistas podem usar uma interface dedicada para estabelecer um plano de montagem de cristal que será então executado pelo robô CrystalDirect.

A tecnologia CrystalDirect baseia-se no uso de uma microplacamento de cristalização de vapor modificado e um raio laser para montar e amostras de cristal crio-cool em suportes compatíveis com difração fechando a lacuna de automação existente entre cristalização e coleta de dados15,16,17. Resumidamente, os cristais são cultivados em uma placa de difusão de vapor modificada, a microplacão CrystalDirect. Uma vez que os cristais aparecem, o robô de colheita CrystalDirect aplica automaticamente um raio laser para extirpar uma peça de filme contendo o cristal, anexá-lo a um pino padrão de coleta de dados de difração e resfriá-lo em um fluxo de gás nitrogênio (ver Zander et al. 2016 e https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Esta tecnologia tem uma série de vantagens adicionais sobre protocolos manuais ou semi-automatizados de montagem de cristais. Por exemplo, o tamanho e a forma dos cristais não é um problema, tornando igualmente fácil a colheita de cristais grandes ou microcristais, muitas vezes é possível evitar o uso de crio-protetores, devido à maneira especial pela qual a tecnologia opera (ver referência 17, Zander et al.), tornando a análise de difração de raios-X muito mais simples. O raio laser também pode ser usado como uma ferramenta cirúrgica para selecionar as melhores partes de uma amostra quando cristais crescem em clusters ou mostram crescimento epitaxial, por exemplo. A tecnologia CrystalDirect também pode ser usada para experimentos automatizados de imersão17. Entrega de soluções com pequenas moléculas ou outros produtos químicos para cristais. Assim, permite suportar a triagem de compostos e fragmentos totalmente automatizados, em larga escala. Uma vez que os cristais são colhidos e criocoolados pelo robô CrystalDirect, eles são transferidos para discos SPINE ou Unipuck que são compatíveis com a maioria dos feixes de cristalografia macromolecular sincronia em todo o mundo. O sistema pode colher até 400 pinos (a capacidade do armazenamento criogênico Dewar) de forma totalmente autônoma. O CRIMS se comunica com o robô colheitadeira durante o processo e fornece rastreamento automatizado de amostras de cristal (discos e pinos). Os discos são marcados com códigos de barras e tags RFID para facilitar o gerenciamento de amostras21,28.

O CRIMS fornece uma interface de programa de aplicativos (API) que suporta comunicação automatizada com o sistema ISPyB que suporta o gerenciamento e processamento de coleta de dados de raios-X em muitos síncrotrons na Europa e no mundo29. Após a coleta automatizada de cristais ser concluída, os cientistas podem selecionar amostras de cristal (discos) e criar remessas de amostras para as linhas de cristalografia macromolecular no ESRF (Grenoble, França)7,8,9 ou Petra III síncrotrons (Hamburgo, Alemanha)18,19. O CRIMS transfere os dados correspondentes às amostras de linha de feixe selecionadas para o sistema de informações síncrotrons, juntamente com parâmetros de coleta de dados pré-selecionados. Uma vez que as amostras chegam à linha de feixe síncrotron selecionada, a coleta de dados de raios-X é realizada manualmente, através da operação de linha de feixe remota ou de forma totalmente automatizada (ou seja, na linha de feixe MASSIF-1 do ESRF8 operada pelo Grupo conjunto de Biologia Estrutural EmBL ESRF (JSBG)). Após a coleta de dados, o CRIMS recupera automaticamente informações sobre os resultados da coleta de dados, juntamente com os resultados iniciais de processamento de dados realizados pelos sistemas de processamento de dados síncrotrons e os apresenta ao cientista através de uma interface de usuário conveniente.

O laboratório HTX aplica esses gasodutos automatizados para suportar três aplicações diferentes, determinações rápidas de novas estruturas, caracterização rápida de complexos de ligantes proteicos e triagem composta e fragmentada em larga escala. Abaixo descrevemos como usá-los e operá-los.

Protocol

NOTA: O acesso financiado a esses gasodutos para cientistas em todo o mundo é apoiado por meio de uma série de programas de financiamento. No momento da redação deste manuscrito, os pedidos de acesso são aceitos através do programa iNEXT Discovery (https://inext-discovery.eu), uma rede europeia de instalações para estimular a biologia estrutural translacional20 financiada pelo programa Horizon 2020 da Comissão Europeia ou instruções-eric (https://instruct-eric.eu/). Entre em contato com o autor correspondente para as modalidades e rotas atuais para acesso financiado em um determinado momento. Este protocolo descreve a operação do gasoduto de proteína para estrutura e inclui etapas comuns a todos os nossos gasodutos, enquanto as especificidades para os outros dois gasodutos são discutidas na seção a seguir. As instruções aqui referem-se a CRIMS V4.0. 1. Laboratório de Cristalização de Alto Rendimento Antes de começar, solicite o registro no laboratório HTX através do sistema CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. As credenciais do usuário fornecem acesso remoto a todas as interfaces experimentais de design e avaliação. Faça login no CRIMS através de um navegador web (Firefox, Chrome e Safari são suportados). O servidor web crims é criptografado para impedir que terceiros acessem dados enquanto ele viaja pela web. Uma vez no CRIMS, uma série de menus à esquerda da triagem ajudam a gerenciar e criar amostras, solicitar experimentos de cristalização, gerenciar e visualizar placas, etc. Uma série de tutoriais em vídeo estão disponíveis em https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.NOTA: Os usuários que enviam amostras por correio precisam registrar as amostras e os experimentos de cristalização solicitados através do CRIMS antes de enviar a amostra para garantir que elas possam ser processadas sem demora na chegada. Por favor, envie os detalhes da remessa para htx@embl.fr. Faça login no CRIMS (https://htxlab.embl.fr) com um navegador da Web e clique no Menu Amostras. Isso abrirá uma interface com ferramentas de gerenciamento de projetos e amostras. Clique no botão Nova Amostra e forneça as informações solicitadas. A CRIMS permite organizar amostras em diferentes projetos, metas e construções. Atribua a amostra aos já existentes ou crie novas neste momento. Uma vez que as informações solicitadas foram inseridas clique em Salvar & Fazer Solicitação. Selecione o protocolo de cristalização, as telas de cristalização a serem usadas, a temperatura de incubação e a data desejada para os experimentos. Use os campos de comentários para fornecer indicações sobre as amostras que são importantes para os operadores de laboratório HTX saberem. Telas personalizadas também podem ser selecionadas (veja abaixo). Após a apresentação da solicitação de cristalização, ela será validada pela equipe do Laboratório HTX e a confirmação sobre o agendamento dos experimentos será enviada por e-mail. Certifique-se de selecionar datas de experimento compatíveis com os tempos necessários para a remessa de amostras. Assim que as amostras chegarem às instalações, os operadores do laboratório HTX realizarão os experimentos conforme solicitado. Uma vez configurados os experimentos de cristalização, a confirmação será enviada por e-mail e as bandejas de cristalização serão transferidas para os imagers automatizados. O CRIMS fornece acesso a todos os parâmetros experimentais e acompanhará automaticamente novas sessões de imagem. As notificações por e-mail serão enviadas automaticamente quando novas imagens estiverem disponíveis. Um experimento de avaliação de qualidade de amostra baseado em30 termospartidores baseado em um protocolo desenvolvido na instalação25,26 é realizado com todas as amostras neste momento e estará disponível através do CRIMS. Imagens dos experimentos de cristalização, juntamente com os resultados da avaliação da qualidade da amostra estarão disponíveis no CRIMS logo após a configuração das bandejas de cristalização. Clique no menu Termofluor e navegue até a amostra para ver os resultados do experimento de avaliação da qualidade da amostra. Clique no menu Placas para ver as imagens das placas de cristalização. Navegue até a amostra e clique em Exibir para ver a última sessão de imagem ou no símbolo + (expandir) para selecionar uma sessão de imagem diferente. Uma série de ferramentas ajudam a encontrar e navegar facilmente através das amostras. Por exemplo, clicar em uma caixa de projeto na parte superior das telas filtra amostras para esse projeto e as funções de pesquisa estão disponíveis para a maioria das colunas de tabela. Use a interface de exibição de placa para ajudar a avaliar e marcar os resultados dos experimentos de cristalização. Permite a navegação através dos diferentes poços das placas de cristalização, selecionar tipos de imagem (ou seja, Vis, UV), selecionar resolução de imagem ou pontuações de registro, por exemplo. Esta interface também fornece todos os parâmetros experimentais utilizados para os experimentos de cristalização, incluindo a composição das soluções de cristalização. Clique no menu Refinement para projetar telas de otimização de cristal com base nas condições de impacto primárias identificadas através da triagem inicial. O submenus Chemicals and Stock Solutions permite que se registre e gerencie as soluções de estoque de cristalização. O submenu Screens fornece acesso a uma interface para projetar sua própria otimização ou telas personalizadas. Selecione o tipo de placa, soluções de estoque ou configurações gradientes que melhor se encaixam no design experimental. É possível pedir ao CRIMS para produzir um arquivo diretamente compatível com o Formulator Robot (Formulatrix) para in pipeta automaticamente as telas na placa ou para produzir um documento imprimível com os volumes para operação manual. Iterar através das etapas 1.2-1.8 para realizar experimentos de otimização de cristais. Uma vez identificados cristais adequados para experimentos de difração de raios-X, navegue até a interface de exibição da placa e selecione a imagem correspondente à gota de cristalização correta. As pontuações pré-armazenadas ajudarão você a fazer isso facilmente. Clique em Crystal Harvesting para gravar um plano automatizado de colheita de cristais para o robô colheitadeira CrystalDirect ou na Colheita Manual para montagem de cristal manual tradicional, se usar CRIMS em uma instalação que não esteja equipada com o CrystalDirect. Ambas as interfaces guiarão o usuário através do processo de colheita de cristais. O CRIMS gravará e armazenará automaticamente a localização dos cristais colhidos em SPINE ou Unipucks21. Selecione o menu Crystal Manager em CRIMS. Clique no submenu de cristais colhidos para inspecionar as amostras congeladas. Ao utilizar a colheitadeira CrystalDirect, são apresentadas imagens do processo de colheita, incluindo imagens dos pinos com os cristais colhidos. Selecione o menu Embarques para se conectar a síncrotrons ESRF ou Petra III e crie remessas de amostras para análise de difração de raios-X. Clique no botão Criar envio e selecione o síncrotron que deseja usar e o número da bolsa (a senha da bolsa no síncrotron é necessária aqui). A próxima série de interfaces são usadas para selecionar os pukcs a serem incluídos na remessa. O sistema permite fornecer comentários para apoiar a coleta de dados e determinar parâmetros de coleta de dados para linhas de feixe automatizadas como o MASSIF-1. Se a coleta de dados estiver sendo realizada no laboratório ESRF ou Petra III HTX, os operadores transferirão as amostras para a linha de trave, a coleta de dados em outros síncrotrons será feita às custas do usuário. É possível coletar dados viajando para o síncrotron, através da operação remota de linha de feixe ou no MASSIF-1. Neste último caso, o processo de coleta de dados é totalmente automatizado. No síncrotron, interfaces específicas no ISPyB29 permitem que os usuários recuperem as informações enviadas pelo CRIMS e associem discos de amostra a ele para que os resultados da coleta de dados sejam rastreados automaticamente. Para os experimentos aqui descritos, a coleta de dados em síncrotrons foi normalmente realizada com o software MXcube31, enquanto o processamento de dados e o refinamento da estrutura foram realizados com atuoPROC32, Staraninso33, BUSTER33, Pipedream32,33 e Coot35. Uma vez realizados experimentos de coleta de dados, o CRIMS recupera informações sumárias, juntamente com os resultados do processamento inicial de dados no síncrotron do sistema ISPyB29. Vá para o menu CRIMS Crystal Manager e clique no subempresa de dados de difração de cristal. Todas as informações e metadados relativos à coleta de dados de difração estão disponíveis. Também é possível baixar dados processados do síncrotron, bem como imagens de difração bruta. Visualize várias coleções de dados ou selecione conjuntos de dados específicos. As ferramentas de gerenciamento de amostras possibilitam navegar e selecionar amostras para construtos de projetos específicos.NOTA: Este pipeline fornece operação totalmente automatizada pela internet, desde proteína pura até resultados de difração de raios-X e pode ser operado com uma ou várias amostras ao mesmo tempo. Pode ser aplicado a diferentes tipos de contexto e projetos em biologia estrutural.

Representative Results

O pipeline de cristalografia automatizado descrito acima foi aplicado para apoiar um grande número de projetos internos e externos com notável sucesso. Alguns destaques incluem o projeto de Djinović-Carugo e colegas de trabalho dos Laboratórios Max Perutz (Viena) com foco na análise estrutural e funcional de um peptidase dipeptidyl essencial para o crescimento de um patógeno bacteriano. A rápida sucessão de triagem de cristalização, avaliação de difração, otimização de cristais e ciclos de coleta de dados de raios-X (até 8 iterações para este projeto) possibilitou a obtenção de modelos estruturais para três diferentes estados conformacionais da proteína em apenas algumas semanas, o que proporcionou uma compreensão mecanicista chave sobre a função desta classe de proteínas36 (ver Figura 1). Outro exemplo é o de Macias e colegas de trabalho do Instituto de Pesquisa Biomédica (IRB, Barcelona) que combinaram ferramentas bioinformáticas e abordagens estruturais para identificar novos motivos de ligação de DNA para os fatores de transcrição SMAD3 e SMAD4 envolvidos na regulação do destino celular. Este trabalho produziu 6 estruturas de alta resolução de SMAD3 & 4 em complexo com diferentes motivos de ligação de DNA37,38 revelando uma capacidade até agora insuspeitável desses fatores de transcrição para reconhecer e vincular a uma variedade diversificada de sequências de DNA, o que é fundamental para a interpretação de sua função em diferentes contextos biológicos. Essas tecnologias também têm sido aplicadas para apoiar pesquisas proprietárias no contexto de projetos de design de medicamentos de grupos de pesquisa em empresas farmacêuticas e biotecnológicas. Por exemplo, graças à rapidez contribuída por esses gasodutos, a análise estrutural de múltiplos complexos de alvo de ligante pode ser alcançada em poucos dias, o que é de grande valor para suportar sucessivas rodadas de otimização da química medicinal no contexto do desenvolvimento de drogas. Finalmente, também aplicamos esta infraestrutura para triagem de fragmentos baseados em raios-X em larga escala39. Figura 1: Pipeline de Cristalografia Automatizada. Operação integrada do laboratório EMBL HTX, incluindo a tecnologia CrystalDirect e o software CRIMS com a linha de feixe MASSIF-1 na ESRF e a comunicação automatizada entre o software CRIMS e ISPyB, permitem suportar pipeline e processamento de proteínas totalmente automatizados e controlados remotamente, integrando triagem e otimização de cristalização, coleta e processamento automatizados de cristais e crio-resfriamento e processamento automatizado de dados. Os modelos estruturais correspondem a três diferentes estados conformais de uma protease de uma bactéria patogênica identificada em tempo recorde pela aplicação destes gasodutos36. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os gasodutos automatizados de cristalografia descritos aqui estão disponíveis para pesquisadores em todo o mundo através de diferentes programas de financiamento. Atualmente, o acesso financiado para experimentos de cristalização e a tecnologia CrystalDirect pode ser obtido aplicando-se ao programa iNEXT Discovery e ao INSTRUCT-ERIC, enquanto o acesso a linhas de cristalografia macromolecular no ESRF é suportado através do programa de acesso ao usuário do ESRF. Essa abordagem minimiza o atraso entre o crescimento e a medição do cristal, acelerando a progressão de projetos muito desafiadores que requerem otimização baseada em difração das condições de produção e cristalização de proteínas e libera os cientistas de operações complexas associadas à cristalização, manuseio de cristais e operação de linha de luz, tornando a cristalografia mais acessível a grupos não especialistas. Também pode ser usado para a rápida exploração de aditivos de cristalização, agentes de eliminação ou para triagem composta através de experimentos de co-cristalização. Embora a maioria dos projetos de cristalografia possam potencialmente se beneficiar dessa abordagem, algumas amostras podem exigir protocolos especiais não favoráveis à automação ou aos gasodutos aqui apresentados, por exemplo aqueles que requerem sistemas microfluidos ou dispositivos de cristalização altamente especializados ou amostras que são extremamente labile e não tolerariam a remessa.

A tecnologia CrystalDirect também permite a imersão automatizada de cristais17 para a caracterização de pequenos complexos de alvo de moléculas. Para isso, uma pequena abertura é criada com o laser antes do processo de colheita e uma gota de uma solução contendo os produtos químicos desejados (ou seja, agentes de corte ou potenciais ligantes) é adicionada em cima, de modo que entre em contato com, e difundir na solução de cristalização eventualmente atingindo o cristal. Soluções químicas podem ser formuladas em água, DMSO ou outros solventes orgânicos. Após um certo tempo de incubação, os cristais podem ser colhidos e analisados por difração como descrito acima. Esta abordagem tem sido aplicada à caracterização rápida de complexos ligantes-proteínas no contexto do design de medicamentos baseados em estrutura, bem como à triagem de compostos e fragmentos em larga escala. Neste último caso, bibliotecas fragmentadas com centenas a mais de mil fragmentos podem ser rapidamente analisadas. Interfaces específicas de CRIMS não apresentadas aqui facilitam o design e o rastreamento automatizado de experimentos de imersão de cristais, enquanto a integração entre o software CRIMS e o conjunto de software Pipedream, desenvolvido pela Global Phasing Ltd (Reino Unido) permitem o processamento automatizado de dados, o processamento de dados, a identificação de ligantes e o refinamento da estrutura sobre centenas de conjuntos de dados em paralelo, simplificando a análise e interpretação de dados32,33 . Por exemplo, este oleoduto foi recentemente aplicado à identificação de fragmentos que ligam tanto ao local ativo quanto a vários sítios alusicos de Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphate synthase, uma enzima-chave do parasita que causa triplosomiase africana humana.

Os gasodutos aqui apresentados podem contribuir para acelerar o ritmo de descoberta na biologia estrutural e tornar a cristalografia macromolecular mais acessível a um número maior de grupos de pesquisa. Além disso, ao facilitar a triagem de compostos e fragmentos em larga escala, eles podem contribuir para fomentar a pesquisa translacional e acelerar o processo de descoberta de drogas, contribuindo para facilitar o desenvolvimento de drogas melhores e mais seguras contra um número maior de alvos.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer ao Grupo conjunto de Biologia Estrutural DA EMBL-ESRF (JSBG) pelo apoio no uso e operação das linhas de feixes macromoleculares da ESRF. Agradecemos a Matthew Bowler pelo apoio com coleta de dados na linha de feixe MASSIF-1 da ESRF e Thomas Schneider e da EQUIPE EMBL Hamburgo pelo excelente suporte com coleta de dados em P14 do síncrotron PetraIII (DESY, Hamburgo, Alemanha). A colheitadeira CrystalDirect é desenvolvida em colaboração com a Equipe de Instrumentação da EMBL Grenoble. Este projeto foi apoiado por financiamento do Programa Comunidade EuropeiaH2020 nos projetos iNEXT (Grant No 653706) e iNEXT Discovery (Grant No 871037), bem como o Région Auvergne-Rhône-Alpes através do programa Booster.

Materials

CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. . Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. . RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Tags

Automated CrystallographyEMBL HTX FacilityGrenobleCrystalDirect TechnologyCRIM SoftwareCrystal Graphic Information Management SystemCrystallization ProtocolCrystallization ScreensHigh Throughput Crystallization LabAutomated ImagersCRIMSCrystallization PlatesCrystallization ExperimentsCrystal HarvestingProtein Structure DeterminationFragment ScreeningLigand Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image