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Biochimica

Le pipeline di cristallografia automatizzate presso lo stabilimento EMBL HTX di Grenoble

Published: June 05, 2021
doi:
10.3791/62491
, , , , , , , , , ,
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

Qui, descriviamo come utilizzare le pipeline automatizzate di cristallografia macromolecolare per l’analisi rapida del complesso ligando-proteina e la selezione rapida del complesso ligando-proteina e lo screening di frammenti su larga scala basato sulla tecnologia CrystalDirect presso il laboratorio HTX di EMBL Grenoble.

Abstract

EMBL Grenoble gestisce l’High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), una struttura utente su larga scala che offre servizi di cristallografia ad alto rendimento agli utenti di tutto il mondo. Il laboratorio HTX ha una forte attenzione nello sviluppo di nuovi metodi nella cristallografia macromolecolare. Attraverso la combinazione di una piattaforma di cristallizzazione ad alto rendimento, la tecnologia CrystalDirect per il montaggio e il crioraffreddamento dei cristalli completamente automatizzati e il software CRIMS abbiamo sviluppato pipeline completamente automatizzate per la cristallografia macromolecolare che possono essere gestite a distanza su Internet. Questi includono una pipeline proteina-struttura per la determinazione di nuove strutture, una pipeline per la rapida caratterizzazione di complessi proteina-ligando a supporto della chimica farmaceutica e una pipeline di screening dei frammenti automatizzata su larga scala che consente la valutazione di librerie di oltre 1000 frammenti. Qui descriviamo come accedere e utilizzare queste risorse.

Introduction

L’automazione è stata introdotta in tutte le fasi del processo sperimentale di cristallografia macromolecolare, dalla cristallizzazione alla raccolta ed elaborazione dei dati di diffrazione1,2,3,4,5,6,7,8,9,comprese una serie di tecnologie per il montaggio su campioni10,11,12 ,13,14,15,16,17. Ciò non solo ha accelerato il ritmo con cui si ottengono le strutture cristallografiche, ma ha contribuito a semplificare applicazioni come la progettazione di farmaci guidati da strutture18,19,20,21,22,23,24. In questo manoscritto descriviamo alcuni degli aspetti delle pipeline di cristallografia automatizzata disponibili presso il laboratorio HTX di Grenoble, nonché le tecnologie sottostanti.

Il laboratorio HTX dell’EMBL Grenoble è una delle più grandi strutture accademiche per lo screening della cristallizzazione in Europa. È co-situato presso il campus European Photon and Neutron (EPN) insieme all’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), che produce alcuni dei fasci di raggi X più brillanti del mondo e all’Institut Laue Langevin (ILL), che fornisce fasci di neutroni ad alto flusso. Dall’inizio delle operazioni nel 2003 il laboratorio HTX ha fornito servizi a oltre 800 scienziati ed elabora più di 1000 campioni all’anno. Il laboratorio HTX ha una forte attenzione allo sviluppo di nuovi metodi nella cristallografia macromolecolare, compresi i metodi per la valutazione dei campioni e il controllo qualità25,26 e la tecnologia CrystalDirect, consentendo il montaggio e l’elaborazione completamente automatizzati deicristalli 15,16,17. Il laboratorio HTX ha anche sviluppato il Crystallographic Information Management System (CRIMS), un sistema informativo di laboratorio basato sul web che fornisce una comunicazione automatizzata tra la cristallizzazione e le strutture di raccolta dei dati di sincrotrone, consentendo un flusso ininterrotto di informazioni sull’intero ciclo del campione dalla proteina pura ai dati di diffrazione. Attraverso la combinazione delle capacità della struttura HTX, della tecnologia CrystalDirect e del software CRIMS, abbiamo sviluppato pipeline proteina-struttura completamente automatizzate che integrano screening di cristallizzazione, ottimizzazione dei cristalli, elaborazione automatizzata della raccolta dei cristalli e crioraffreddamento e raccolta di dati a raggi X a più sincrotroni in un unico flusso di lavoro continuo che può essere gestito in remoto tramite un browser web. Queste pipeline possono essere applicate per supportare la rapida determinazione di nuove strutture, la caratterizzazione di complessi proteina-ligando e lo screening di composti e frammenti su larga scala attraverso la cristallografia a raggi X.

Il laboratorio HTX è dotato di un robot di cristallizzazione non a volume (incluso un modulo LCP che consente la cristallizzazione di proteine solubili e di membrana), di cristalli (a 5 °C e 20 °C), due stazioni robotizzate di gestione dei liquidi per preparare schermi di cristallizzazione e due raccoglitrici di cristalli CrystalDirect automatizzate con capacità di produrre e immagazzinare fino a 400 perni di campione congelati per ciclo operativo. Gli scienziati inviano i loro campioni alla struttura tramite corriere espresso, che vengono poi elaborati da tecnici dedicati presso il laboratorio HTX. Gli scienziati possono progettare da remoto esperimenti di screening e ottimizzazione della cristallizzazione attraverso un’interfaccia web fornita dal sistema CRIMS. Attraverso questa interfaccia, possono scegliere tra una vasta gamma di parametri e protocolli sperimentali disponibili presso la struttura per soddisfare le loro specifiche esigenze di campionamento. I risultati insieme a tutti i parametri sperimentali sono resi disponibili agli utenti in tempo reale tramite CRIMS. Tutti i campioni ricevuti vengono analizzati attraverso un metodo appositamente sviluppato che consente di stimare la probabilità di cristallizzazione del campione25,26,27. Sulla base dei risultati di questo test, vengono fatte raccomandazioni specifiche agli utenti per quanto riguarda la temperatura di incubazione ottimale e possibili esperimenti di ottimizzazione del campione. Una volta impostati gli esperimenti di cristallizzazione, lo scienziato può valutare i risultati osservando le immagini di cristallizzazione raccolte in diversi punti temporali attraverso il web. Quando vengono identificati cristalli adatti per esperimenti di diffrazione a raggi X, gli scienziati possono utilizzare un’interfaccia dedicata per stabilire un piano di montaggio del cristallo che verrà quindi eseguito dal robot CrystalDirect.

La tecnologia CrystalDirect si basa sull’utilizzo di una micropiastra di cristallizzazione a diffusione di vapore modificata e di un raggio laser per montare e crio-raffreddare campioni di cristallo in supporti compatibili con la diffrazione che colmano il divario di automazione esistente tra cristallizzazione e raccolta dati15,16,17. In breve, i cristalli vengono coltivati in una piastra di diffusione del vapore modificata, la micropiastra CrystalDirect. Una volta che i cristalli appaiono, il robot di raccolta CrystalDirect applica automaticamente un raggio laser per asportare un pezzo di pellicola contenente il cristallo, collegarlo a un pin di raccolta dati di diffrazione standard e crio-raffreddarlo in un flusso di gas azoto (vedi Zander et al. 2016 e https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Questa tecnologia presenta una serie di vantaggi aggiuntivi rispetto ai protocolli di montaggio manuale o semi-automatico del cristallo. Ad esempio, la dimensione e la forma dei cristalli non è un problema, rendendo altrettanto facile la raccolta di cristalli di grandi dimensioni o microcristalli, è spesso possibile evitare l’uso di crio-protettivi, a causa del modo speciale in cui la tecnologia opera (vedi riferimento 17, Zander et al.), rendendo l’analisi della diffrazione a raggi X molto più semplice. Il raggio laser può anche essere utilizzato come strumento chirurgico per selezionare le parti migliori di un campione quando i cristalli crescono su grappoli o mostrano una crescita epitassiale, ad esempio. La tecnologia CrystalDirect può essere utilizzata anche per esperimenti di ammollo automatizzati17. Consegna di soluzioni con piccole molecole o altre sostanze chimiche ai cristalli. In questo modo consente di supportare lo screening di composti e frammenti completamente automatizzato e su larga scala. Una volta che i cristalli vengono raccolti e crioraffreddati dal robot CrystalDirect, vengono trasferiti su spine o unipuck pucks che sono compatibili con la maggior parte delle linee di cristallografia macromolecolare sincrona in tutto il mondo. Il sistema può raccogliere fino a 400 pin (la capacità dello stoccaggio criogenico Dewar) in modo completamente autonomo. CRIMS comunica con il robot mietitrebbiatore durante il processo e fornisce il tracciamento automatico dei campioni di cristallo (puck e spilli). I puck sono contrassegnati sia con codici a barre che con tag RFID per facilitare la gestione dei campioni21,28.

CRIMS fornisce un’interfaccia di programma applicativo (API) che supporta la comunicazione automatizzata con il sistema ISPyB che supporta la gestione e l’elaborazione della raccolta e dell’elaborazione dei dati a raggi X in molti sincrotroni in Europa e nel mondo29. Una volta completata la raccolta automatica dei cristalli, gli scienziati possono selezionare campioni di cristallo (puck) e creare spedizioni di campioni per le linee di fascio della cristallografia macromolecolare presso l’ESRF (Grenoble, Francia)7,8,9 o i sincrotroni Petra III (Amburgo, Germania)18,19. CRIMS trasferisce i dati corrispondenti ai campioni di beamline selezionati al sistema informativo di sincrotrone insieme a parametri di raccolta dati preselezionati. Una volta che i campioni arrivano alla beamline di sincrotrone selezionata, la raccolta dei dati a raggi X viene effettuata manualmente, attraverso il funzionamento remoto della beamline o in modo completamente automatizzato (ad esempio, alla beamline MASSIF-1 dell’ESRF8 gestita dal joint EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Dopo la raccolta dei dati, CRIMS recupera automaticamente le informazioni sui risultati della raccolta dei dati insieme ai risultati iniziali dell’elaborazione dei dati effettuati dai sistemi di elaborazione dei dati di sincrotrone e le presenta allo scienziato attraverso una comoda interfaccia utente.

Il laboratorio HTX applica queste pipeline automatizzate per supportare tre diverse applicazioni, determinazioni rapide di nuove strutture, rapida caratterizzazione di complessi proteina-ligando e screening di composti e frammenti su larga scala. Di seguito descriviamo come utilizzarli e utilizzarli.

Protocol

NOTA: l’accesso finanziato a questi gasdotti per gli scienziati di tutto il mondo è supportato da una serie di programmi di finanziamento. Al momento della stesura di questo manoscritto le domande di accesso sono accettate attraverso il programma iNEXT Discovery (https://inext-discovery.eu), una rete europea di strutture per stimolare la biologia strutturale traslazionale20 finanziata dal programma Horizon 2020 della Commissione europea o INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Contattare l’autore corrispondente per le modalità e i percorsi correnti per l’accesso finanziato in un determinato momento. Questo protocollo descrive il funzionamento della pipeline proteina-struttura e include passaggi comuni a tutte le nostre pipeline, mentre le specificità per le altre due pipeline sono discusse nella sezione seguente. Le istruzioni qui riportate si riferiscono a CRIMS V4.0. 1. Laboratorio di cristallizzazione ad alta produttività Prima di iniziare, richiedi la registrazione al laboratorio HTX attraverso il sistema CRIMS https://htxlab.embl.fr/#/. Le credenziali utente forniscono l’accesso remoto a tutte le interfacce di progettazione e valutazione sperimentale. Accedi a CRIMS tramite un navigatore web (Firefox, Chrome e Safari sono supportati). Il server Web CRM è crittografato per impedire a terzi di accedere ai dati mentre viaggia attraverso il Web. Una volta in CRIMS, una serie di menu a sinistra dello screening aiutano a gestire e creare campioni, richiedere esperimenti di cristallizzazione, gestire e visualizzare piastre, ecc. Una serie di video tutorial sono disponibili su https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.NOTA: Gli utenti che inviano campioni tramite corriere devono registrare i campioni e gli esperimenti di cristallizzazione richiesti tramite CRIMS prima di inviare il campione per garantire che possano essere elaborati senza indugio all’arrivo. Si prega di inviare i dettagli della spedizione a htx@embl.fr. Accedere a CRIMS (https://htxlab.embl.fr ) con un browser Web e fare clic sul menu Campioni. Si aprirà un’interfaccia con gli strumenti di gestione del progetto e dell’esempio. Fare clic sul pulsante Nuovo campione e fornire le informazioni richieste. CRIMS consente di organizzare i campioni sotto diversi progetti, obiettivi e costrutti. Assegna l’esempio a quelli esistenti o creane di nuovi a questo punto. Una volta inserite le informazioni richieste clicca su Salva & Effettua Richiesta. Selezionare il protocollo di cristallizzazione, gli schermi di cristallizzazione da utilizzare, la temperatura di incubazione e la data desiderata per gli esperimenti. Utilizzare i campi dei commenti per fornire indicazioni sui campioni che sono importanti per gli operatori di laboratorio HTX. È inoltre possibile selezionare schermate personalizzate (vedi sotto). Dopo aver inviato la richiesta di cristallizzazione verrà convalidata dal team di laboratorio HTX e la conferma sulla programmazione degli esperimenti verrà inviata via e-mail. Assicurati di selezionare le date degli esperimenti compatibili con i tempi richiesti per la spedizione dei campioni. Una volta che i campioni arrivano nella struttura, gli operatori del laboratorio HTX eseguiranno gli esperimenti come richiesto. Una volta impostati gli esperimenti di cristallizzazione, la conferma verrà inviata via e-mail e i vassoi di cristallizzazione verranno trasferiti agli imager automatici. CRIMS fornisce l’accesso a tutti i parametri sperimentali e monitorerà automaticamente le nuove sessioni di imaging. Le notifiche via e-mail verranno inviate automaticamente quando saranno disponibili nuove immagini. Un esperimento di valutazione della qualità di30 campioni a base di termofluore basato su un protocollo sviluppato presso la struttura25,26 viene effettuato con ogni campione a questo punto e sarà disponibile tramite CRIMS. Le immagini degli esperimenti di cristallizzazione insieme ai risultati della valutazione della qualità del campione saranno disponibili in CRIMS poco dopo l’affisso dei vassoi di cristallizzazione. Fare clic sul menu Thermofluor e passare al campione per visualizzare i risultati dell’esperimento di valutazione della qualità del campione. Clicca sul menu Piastre per vedere le immagini delle piastre di Cristallizzazione. Passare all’esempio e fare clic su Visualizza per visualizzare l’ultima sessione di imaging o sul simbolo + (espandi) per selezionare una sessione di imaging diversa. Una serie di strumenti aiuta a trovare e navigare facilmente attraverso gli esempi. Ad esempio, facendo clic in una casella di progetto nella parte superiore delle schermate vengono forniti esempi di filtri per tale progetto e le funzioni di ricerca sono disponibili per la maggior parte delle colonne della tabella. Utilizzate l’interfaccia plate View per valutare e valutare i risultati degli esperimenti di cristallizzazione. Consente la navigazione attraverso i diversi pozzi delle piastre di cristallizzazione, selezionare i tipi di immagine (ad esempio, Vis, UV), selezionare la risoluzione dell’immagine o registrare i punteggi, ad esempio. Questa interfaccia fornisce anche tutti i parametri sperimentali utilizzati per gli esperimenti di cristallizzazione, compresa la composizione delle soluzioni di cristallizzazione. Fare clic sul menu Perfezionamento per progettare schermate di ottimizzazione dei cristalli in base alle condizioni di hit primarie identificate attraverso lo screening iniziale. I sottomenu Chemicals and Stock Solutions consentono di registrare e gestire le soluzioni stock di cristallizzazione. Il sottomenu Schermate fornisce l’accesso a un’interfaccia per progettare la propria ottimizzazione o schermate personalizzate. Selezionare il tipo di piastra, le soluzioni di riserva o le configurazioni di gradiente che meglio si adattano al progetto sperimentale. E’ possibile chiedere a CRIMS di produrre un file direttamente compatibile con il Formulator Robot (Formulatrix) per pipettare automaticamente gli schermi nella piastra o per produrre un documento stampabile con i volumi per il funzionamento manuale. Scorrere i passaggi 1.2-1.8 per eseguire esperimenti di ottimizzazione dei cristalli. Una volta identificati i cristalli adatti per gli esperimenti di diffrazione a raggi X, passare all’interfaccia di vista della piastra e selezionare l’immagine corrispondente alla giusta goccia di cristallizzazione. I punteggi pre-memorizzati ti aiuteranno a farlo facilmente. Fare clic su Crystal Harvesting per registrare un piano di raccolta automatica dei cristalli per il robot mietitrebbiatore CrystalDirect o su Raccolta manuale per il tradizionale montaggio manuale del cristallo, se si utilizza CRIMS in una struttura non dotata di CrystalDirect. Entrambe le interfacce guideranno l’utente attraverso il processo di raccolta dei cristalli. CRIMS registrerà e memorizzerà automaticamente la posizione dei cristalli raccolti in SPINE o Unipucks21. Selezionare il menu Crystal Manager in CRIMS. Fare clic sul sottomenu Cristalli raccolti per ispezionare i campioni congelati. Quando si utilizza la mietitrice CrystalDirect, vengono presentate immagini del processo di raccolta, comprese le immagini dei perni con i cristalli raccolti. Selezionare il menu Spedizioni per connettersi ai sincrotroni ESRF o Petra III e creare spedizioni di campioni per l’analisi della diffrazione a raggi X. Fare clic sul pulsante Crea spedizione e selezionare il sincrotrone che si desidera utilizzare e il numero del bagaglio (la password del bagaglio al sincrotrone è necessaria qui). La successiva serie di interfacce viene utilizzata per selezionare i pukc da includere nella spedizione. Il sistema consente di fornire commenti per supportare la raccolta dei dati e determinare i parametri di raccolta dei dati per le linee di fascio automatizzate come MASSIF-1. Se la raccolta dei dati viene effettuata presso il laboratorio ESRF o Petra III HTX, gli operatori trasferiranno i campioni alla beamline, la raccolta dei dati presso altri sincrotroni verrà effettuata a spese dell’utente. È possibile raccogliere dati viaggiando verso il sincrotrone, attraverso il funzionamento remoto della beamline o al MASSIF-1. In quest’ultimo caso, il processo di raccolta dei dati è completamente automatizzato. Al sincrotrone, interfacce specifiche in ISPyB29 consentono agli utenti di recuperare le informazioni inviate da CRIMS e associare puck campione ad esso in modo che i risultati della raccolta dei dati vengano tracciati automaticamente. Per gli esperimenti qui descritti, la raccolta dei dati ai sincrotroni è stata tipicamente effettuata con il software MXcube31, mentre l’elaborazione dei dati e il perfezionamento della struttura sono stati effettuati con atuoPROC32, Staraninso33, BUSTER33, Pipedream32,33 e Coot35. Una volta effettuati gli esperimenti di raccolta dei dati, CRIMS recupera le informazioni di riepilogo insieme ai risultati dell’elaborazione iniziale dei dati al sincrotrone dal sistema ISPyB29. Andare al menu CRIMS Crystal Manager e fare clic sul sottomenu Dati di diffrazione di cristallo. Sono disponibili tutte le informazioni e i metadati relativi alla raccolta dei dati di diffrazione. È anche possibile scaricare i dati elaborati dal sincrotrone e le immagini di diffrazione grezze. Visualizzare più raccolte di dati o selezionare set di dati specifici. Gli strumenti di gestione degli esempi consentono di esplorare e selezionare esempi per costrutti di progetti specifici.NOTA: questa pipeline fornisce un funzionamento completamente automatizzato su Internet, dalle proteine pure ai risultati della diffrazione a raggi X e può essere utilizzata con uno o più campioni contemporaneamente. Può essere applicato a diversi contesti e tipi di progetto in biologia strutturale.

Representative Results

La pipeline di cristallografia automatizzata sopra descritta è stata applicata per supportare un gran numero di progetti interni ed esterni con notevole successo. Alcuni punti salienti includono il progetto di Djinović-Carugo e dei collaboratori dei Laboratori Max Perutz (Vienna) incentrati sull’analisi strutturale e funzionale di una dipeptidil peptidasi essenziale per la crescita di un agente patogeno batterico. La rapida successione di screening di cristallizzazione, valutazione della diffrazione, ottimizzazione dei cristalli e cicli di raccolta dei dati a raggi X (fino a 8 iterazioni per questo progetto) ha permesso di ottenere modelli strutturali per tre diversi stati conformazionali della proteina in poche settimane, che hanno fornito una comprensione meccanicistica chiave sulla funzione di questa classe di proteine36 (vedi Figura 1). Un altro esempio è quello di Macias e dei colleghi dell’Istituto di ricerca biomedica (IRB, Barcellona) che hanno combinato strumenti bioinformatici e approcci strutturali per identificare nuovi motivi di legame del DNA per i fattori di trascrizione SMAD3 e SMAD4 coinvolti nella regolazione del destino cellulare. Questo lavoro ha prodotto 6 strutture ad alta risoluzione di SMAD3 & 4 in complesso con diversi motivi di legame del DNA37,38 rivelando una capacità finora insospettata di questi fattori di trascrizione di riconoscere e legarsi a una vasta gamma di sequenze di DNA, che è la chiave per l’interpretazione della loro funzione in diversi contesti biologici. Queste tecnologie sono state applicate anche per supportare la ricerca proprietaria nel contesto di progetti di progettazione di farmaci da parte di gruppi di ricerca in aziende farmaceutiche e biotecnologiche. Ad esempio, grazie alla rapidità con cui contribuiscono queste pipeline, l’analisi strutturale di più complessi ligando-target può essere raggiunta in pochi giorni, il che è di grande valore per supportare cicli successivi di ottimizzazione della chimica farmaceutica nel contesto dello sviluppo di farmaci. Infine abbiamo anche applicato questa infrastruttura per lo screening dei frammenti basato su raggi X su larga scala39. Figura 1: Pipeline di cristallografia automatizzata. Il funzionamento integrato del laboratorio EMBL HTX, tra cui la tecnologia CrystalDirect e il software CRIMS con la beamline MASSIF-1 presso ESRF e la comunicazione automatizzata tra il software CRIMS e ISPyB, consentono di supportare una pipeline proteina-struttura completamente automatizzata e controllata a distanza che integra screening e ottimizzazione della cristallizzazione, raccolta e crio-raffreddamento automatizzati e raccolta ed elaborazione automatizzata dei dati. I modelli strutturali corrispondono a tre diversi stati conformazionali di una proteasi da un batterio patogeno identificato in tempi record applicando queste pipeline36. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Le pipeline di cristallografia automatizzata qui descritte sono disponibili per i ricercatori di tutto il mondo attraverso diversi programmi di finanziamento. Attualmente, l’accesso finanziato per esperimenti di cristallizzazione e la tecnologia CrystalDirect può essere ottenuto applicando al programma iNEXT Discovery e INSTRUCT-ERIC, mentre l’accesso alle linee di fascio di cristallografia macromolecolare presso l’ESRF è supportato attraverso il programma di accesso utente ESRF. Questo approccio riduce al minimo il ritardo tra la crescita e la misurazione dei cristalli, accelerando la progressione di progetti molto impegnativi che richiedono l’ottimizzazione basata sulla diffrazione della produzione di proteine e delle condizioni di cristallizzazione e libera gli scienziati da operazioni complesse associate alla cristallizzazione, alla gestione dei cristalli e al funzionamento della beamline, rendendo la cristallografia più accessibile ai gruppi di non esperti. Può anche essere utilizzato per una rapida esplorazione di additivi di cristallizzazione, agenti di fasatura o per lo screening dei composti attraverso esperimenti di co-cristallizzazione. Mentre la maggior parte dei progetti di cristallografia potrebbe potenzialmente beneficiare di questo approccio, alcuni campioni potrebbero richiedere protocolli speciali non suscettibili di automazione o alle pipeline qui presentate, ad esempio quelli che richiedono sistemi microfluidici o dispositivi di cristallizzazione altamente specializzati o campioni che sono estremamente labili e non tollererebbero la spedizione.

La tecnologia CrystalDirect consente inoltre l’immersione automatizzata deicristalli 17 per la caratterizzazione di piccoli complessi molecola-bersaglio. Per questo, una piccola apertura viene creata con il laser prima del processo di raccolta e una goccia di una soluzione contenente le sostanze chimiche desiderate (cioè agenti di fasatura o potenziali ligandi) viene aggiunta sulla parte superiore, in modo che entri in contatto e si diffonda nella soluzione di cristallizzazione raggiungendo infine il cristallo. Le soluzioni chimiche possono essere formulate in acqua, DMSO o altri solventi organici. Dopo un certo tempo di incubazione i cristalli possono essere raccolti e analizzati per diffrazione come descritto sopra. Questo approccio è stato applicato alla rapida caratterizzazione di complessi ligando-proteina nel contesto della progettazione di farmaci basati sulla struttura, nonché allo screening di composti e frammenti su larga scala. In quest’ultimo caso è possibile analizzare rapidamente librerie di frammenti con centinaia o oltre mille frammenti. Interfacce CRIMS specifiche non qui presentate facilitano la progettazione e il tracciamento automatizzato degli esperimenti di immersione dei cristalli, mentre l’integrazione tra il software CRIMS e la suite software Pipedream, sviluppata da Global Phasing Ltd (Regno Unito) consente l’elaborazione automatizzata dei dati, il phasing, l’identificazione del ligando e il perfezionamento della struttura su centinaia di set di dati in parallelo, semplificando l’analisi e l’interpretazione dei dati32,33 . Ad esempio, questa pipeline è stata recentemente applicata all’identificazione di frammenti che si legano sia al sito attivo che a diversi siti allosterici di Trypanosoma brucei farnesil pirofosfato sintasi, un enzima chiave del parassita che causa la tripanosomiasi africana umana.

Le pipeline qui presentate possono contribuire ad accelerare il ritmo della scoperta in biologia strutturale e rendere la cristallografia macromolecolare più accessibile a un numero maggiore di gruppi di ricerca. Inoltre, facilitando lo screening su larga scala di composti e frammenti, possono contribuire a promuovere la ricerca traslazionale e accelerare il processo di scoperta di farmaci, contribuendo a facilitare lo sviluppo di farmaci migliori e più sicuri contro un numero maggiore di obiettivi.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vogliamo ringraziare il gruppo congiunto EMBL-ESRF Structural Biology Group (JSBG) per il supporto nell’uso e nel funzionamento delle linee di fascio macromolecolari ESRF. Siamo grati a Matthew Bowler per il supporto con la raccolta dei dati presso la beamline MASSIF-1 di ESRF e Thomas Schneider e al team EMBL di Amburgo per l’eccellente supporto con la raccolta dei dati al P14 del sincrotrone PetraIII (DESY, Amburgo, Germania). La mietitrebbia CrystalDirect è sviluppata in collaborazione con il team di strumentazione dell’EMBL grenoble. Questo progetto è stato sostenuto da finanziamenti del programma comunitarioH2020 nell’ambito dei progetti iNEXT (Grant No 653706) e iNEXT Discovery (Grant No 871037) e della Région Auvergne-Rhône-Alpes attraverso il programma Booster.

Materials

CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
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Riferimenti

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. . Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. . RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

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Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).
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