Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

Rochester Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan bu çalışmada daha önce SARS-CoV-2 tanı analizleri için test edilen artık insan serum örnekleri kullanılmıştır. 1. Reaktifler ve ekipmanlar Ticari kaynaklardan koronavirüs antijenleri ve insan IgG ve IgM elde edin. Test kontrolü (AC) boncuk setlerini (45 ve 220) cihaz satıcısından alın. AC boncuk seti 45 monitörler OrtaNca Floresan Yoğunluğu (MFI) koleksiyonu tek muhabir kanalı (RP1) enstrümanlarında. AC boncuk seti 220 ikinci muhabir kanalında (RP2) MFI koleksiyonunu izler. Algılama antikorları ve antijene özgü tavşan serası ve kavrama onayı için kullanılan antikorları elde edin. Bir streptavidin, R-phycoerythrin konjuge (SAPE) veya florofor Super Bright 436 ‘nın (SASB; 405 nanometrede (nm) eksitasyon ve 436 nm emisyondan oluşan bir streptavidin konjugesi ile biotin etiketli antikorlarla tespiti gerçekleştirin. İnsan ACE2 proteini (yani SARS Reseptörü) elde edin. Kullanmadan önce, nükleaz içermeyen suda (DEPC işlem görmüş, otoklavlı ve 0,2-μm steril filtrelenmemiş) 1 mg/mL konsantrasyonda çözünerek liyofilize ACE2 proteini rehidrat ve 4 °C’de saklayın. Tüm reaksiyonları 96 kuyuya bağlı olmayan yüzey (NBS) siyah düz tabanlı plakalarda gerçekleştirin. Plakaları 96 kuyu mikro plakalı alüminyum sızdırmazlık bandı ile tahlil inkübasyon adımları için kapatın. Test yıkama adımları için manyetik bir plaka ayırıcı kullanın. 2. Antijen bağlantılı ve antikor bağlantılı kontrol boncukları hazırlama Cameron ve ark.1’deaçıklandığı gibi S, RBD ve Nc antijenleri ile manyetik, polistiren ve renk kodlu mikroküren setlerini (6,5-μm çapında) eş zamanlı olarak birleştirilmiştir. Koronavirüs antijenleri 10 pmol/106 boncuk (S) ve 100 pmol/106 boncukta (RBD ve Nc) birleştirilmiştir. İnsan IgG veya IgM ile birleştirilen kontrol boncukları daha önce açıklandığı gibi oluşturulur1. IgG ve IgM 5 μg/106 boncukta birleştirilmiştir. Kaplinden sonra, boncuk konsantrasyonlarını belirleyin ve açıklanan prosedürleri kullanarak her stoğu 1 x10 6 boncuk / mL’ye seyreltin6. Cameron ve ark.1’deaçıklandığı gibi, tavşandan antijene özgü antikorlarla veya pozitif insan serasıyla antijen bağlantısı teyidi gerçekleştirin. Tahlilin biyotinilize anti-insan IgG/SAPE algılama reaktifleri ile insan IgG bağlantısı ve bir fikoerythrin (PE) etiketli keçi anti-insan IgM ile IgM bağlantısı onaylayın.NOT: Kavrama onayı proteine özgü serum veya antikor titrasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, çünkü bu reaktifler için kullanılacak en uygun konsantrasyon bilinmemektedir. Serum için seri kat seyreltmeler kullanılırken mg/mL stokları olarak sağlanan antikorlar için seri μg/mL seyreltme serileri kullanılır. İki muhabir kanalında MFI koleksiyonunu izleyen test kontrolü (AC) boncuklarını, çok yönlü boncuk karışımlarında kullanmadan önce 1 x10 6 boncuk/mL konsantrasyonda seyreltin. 3. Taze multipleks boncuk karışımı hazırlığı Çok sayıda boncuk hazırlayın ve 1 x 106 boncuk/mL’de boncuk stoklarını kontrol edin.NOT: Multipleks boncuk karışımları, her boncuk bölgesi için 50 μL hacimde 2.500 boncuk teslim etmek için hazırlanır. Herhangi bir sayıda reaksiyon için çoklamalı boncuk karışımlarının nasıl hazırlanacağına ilişkin hesaplamalar Angeloni (2020) tarafından yayınlanan blogda açıklanmıştır6. 4. Örnek seyreltme %0,05 Ara 20, %0,02 sodyum azit ve %1 sığır serum albümini (BSA) (PBS-TBN tamponu) içeren 990 μL fosfat tamponlu saline (PBS) 1:100 μL serum karıştırarak 1:100 serum örnek seyreltme hazırlayın. 1:100 seyreltmenin 20 μL’lik kısmını 180 μL PBS-TBN’ye ekleyerek numuneleri tekrar 10 kat seyreltin.NOT: Serum örnekleri, COVID-19 pandemisi öncesinde 2019 yılında toplanan örneklerden negatif sera ve sars-CoV-2 PCR pozitif hastalardan düşük ve yüksek antikor titrelerini temsil eden pozitif seradan oluşur. Pozitif örnekler semptom başlangıcından (DFSO) itibaren ≈3 ila >60 gün arasında toplanarak alındı. Tüm serum örnekleri ve IgG sıyrılmış negatif kontrol serası aşağıda açıklandığı gibi 1:1000’e kadar seyreltilir. Nötralizasyon tahlilleri için sera, aşağıdaki nötralizasyon protokollerinde (bölüm 6 ve 8) açıklandığı gibi 1:500 seyreltilir. 5. Tek muhabir serolojik tahlil protokolü 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakanın atanmış her kuyusuna 50 μL çok katlı boncuk karışımı ekleyin. Uygun kuyulara pipet 50 μL 1:1000 serum veya PBS-TBN; Serumun kuyudaki son seyreltilmesi 1:2000’dir. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ilk numune sonrası kuluçka yıkama). Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca plaka mıknatısına yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ikinci numune sonrası kuluçka yıkama). Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca plaka mıknatısına yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatıstan çıkarın. Antikoru 0,62 μg/mL’ye ve SAPE’yi 1 μg/mL’ye seyrelterek SAPE ile biyotin-anti-insan IgG’nin taze bir karışımını yapın. Her kuyuya 100 μL ekleyin. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ilk tespit sonrası antikor inkübasyon yıkama). Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca plaka mıknatısına yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ikinci tespit sonrası antikor inkübasyon yıkama). Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatıstan çıkarın. Her kuyuya 100 μL PBS-TBN ekleyin. Folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın. Daha sonra folyo contayı çıkarın ve Kullanım Kılavuzu’na göre akış analizöründeki her kuyunun 50 μL’sini okuyun. Aşağıda kısa bir açıklama verilmiştir. Ekranın sol üst köşesindeki açılır menüyü seçin ve Plaka Yapılandırması’na gidin. Çalışma Plakası ‘nınöğesini seçin. Plaka taşıyıcısını çıkarmak için Çıkar simgesini seçin. Plakayı plaka taşıyıcısına yükleyin ve plaka taşıyıcısını geri çekmek için Geri Çek simgesini seçin. Plakayı çalıştırmak için Çalıştır simgesini seçin. 6. Tek muhabir nötralizasyon tahlil protokolü Yukarıdaki bölüm 3’te açıklandığı gibi taze bir çoklayıcı boncuk karışımı hazırlayın. Hastayı seyreltin ve sera 1:500’i aşağıdaki gibi kontrol edin. 10 μL serumu 990 μL PBS-TBN’ye karıştırarak serum 1:100’u seyreltin. 160 μL PBS-TBN’ye 40 μL 1:100 serum ekleyerek serumu 5 kat daha seyreltin. 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakanın atanmış her kuyusuna 50 μL çok katlı boncuk karışımı ekleyin. Her kuyuya 25 μL 2 μg/mL ACE2 seyreltme ekleyin. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 2 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve folyo contayı çıkarın. Atanan kuyulara 25 μL 1:500 serum veya PBS-TBN ekleyin. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Tahlil prosedürünün geri kalanı için, yukarıda açıklandığı gibi 5.4 ile 5.18.5 arasında olan adımları izleyin. 7. Çift muhabir IgG ve IgM serolojik teste dönüştürme Yukarıdaki Bölüm 2’de açıklandığı gibi antijen bağlantılı boncuklar hazırlayın.NOT: İnsan IgM ile birlikte ek bir boncuk seti, anti-IgM algılama reaktiflerinin yanı sıra RP2 için MFI koleksiyonunu izlemek için ek bir AC boncuk seti (220) eklenmesini izlemek için dahildir. Tüm boncuk stokları, aşağıda açıklandığı gibi çok yönlü boncuk karışımlarına dahil edilmek üzere 1 x10 6 boncuk / mL’dedir. Yukarıdaki Bölüm 3’te açıklandığı gibi taze çoklayıcı boncuk karışımları hazırlayın. Yukarıdaki Bölüm 4’te açıklandığı gibi serum örneklerini seyreltin ve IgG-sıyrılmış negatif kontrol sera 1:1000. 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakanın atanmış her kuyusuna 50 μL çok katlı boncuk karışımı ekleyin. Pipet 50 μL 1:1000 serum veya PBS-TBN uygun kuyulara. Serumun kuyudaki son seyreltilmesi 1:2000’dir. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ilk numune sonrası kuluçka yıkama). Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca plaka mıknatısına yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. 7.10.1-7.10.5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi, reaksiyon kuyularını PBS-TBN (ikinci numune sonrası kuluçka yıkama) ile tekrar yıkayın. Plakayı mıknatıstan çıkarın. Gerekli reaktif kombinasyonu ile yeni bir Algılama Reaktif karışımı yapın ve her kuyuya 50 μL veya 100 μL ekleyin.NOT: Brilliant Violet 421 muhabir boyasına (BV; 405 nm’de eksitasyon ve 421 nm’de emisyon) konjuge edilen anti-human IgG içeren Algılama Reaktif karışımları, mevcut stok reaktiflerinin sınırlı miktarları nedeniyle 50 μL / kuyuda kullanılmıştır. Diğer tüm Algılama Reaktif karışımları 100 μL/kuyuda kullanılır. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi PBS-TBN ile yıkayın (antikor inkübasyonu tespit edildikten sonra ilk yıkama). Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. 7.17.1-7.17.5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi, reaksiyon kuyularını PBS-TBN (tespit antikor inkübasyonundan sonra ikinci yıkama) ile tekrar yıkayın. Plakayı mıknatıstan çıkarın. Her kuyuya 100 μL PBS-TBN ekleyin. Folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın. Daha sonra folyo contayı çıkarın ve 5.18.1-5.18-5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi akış analizöründeki her kuyunun 50 μL’sini okuyun. 8. Çift muhabir nötralizasyon testine dönüştürme Yukarıdaki 7.1 adımında açıklandığı gibi birleştirilmiş boncukları kullanın. 7.2 adımında açıklandığı gibi yeni bir çoklayıcı boncuk karışımı hazırlayın. Serum örnekleri ve IgG-sıyrılmış negatif kontrol serası aşağıdaki gibi 1:500 seyreltilir. 10 μL serumu 990 μL PBS-TBN’ye karıştırarak 1:100 seyreltme hazırlayın. 1:100 numuneleri 1:100 μL’den 160 μL PBS-TBN’ye 40 μL ekleyerek 5 kat daha seyreltin. 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakanın atanmış her kuyusuna 50 μL çok katlı boncuk karışımı ekleyin. Her kuyuya 25 μL 2 μg/mL ACE2 seyreltme ekleyin. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 2 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve folyo contayı çıkarın. Atanan kuyulara 25 μL 1:500 serum veya PBS-TBN ekleyin. Plakayı bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ilk numune sonrası kuluçka yıkama). Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. 8.13.1-8.13.5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi, reaksiyon kuyularını PBS-TBN (ikinci numune sonrası kuluçka yıkama) ile tekrar yıkayın. Plakayı mıknatıstan çıkarın. Gerekli reaktif kombinasyonu ile yeni bir Algılama Reaktif karışımı yapın ve her kuyuya 50 μL veya 100 μL ekleyin.NOT: BV muhabir boyasına konjuge edilen anti-human IgG’yi içeren Algılama Reaktif karışımları, mevcut stok reaktiflerinin sınırlayıcı miktarları nedeniyle 50 μL / kuyuda kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu). Diğer tüm Algılama Reaktif karışımları 100 μL/kuyuda kullanılır. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C’de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm’de sallanarak kuluçkaya yatırın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (birincisi antikor inkübasyonunun tespit edilmesinden sonraydı). Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın. Reaksiyon kuyularını PBS-TBN (antikor inkübasyonu tespit edildikten sonra ikinci yıkama) ile tekrar yıkayın, tam olarak yukarıda 8.21.1-8.21.5 adımlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 600 rpm’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın. Plakayı mıknatıstan çıkarın. Her kuyuya 100 μL PBS-TBN ekleyin. Folyo conta ile örtün ve 37 °C’de 2 dakika çalkalayın. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın. Daha sonra folyo contayı çıkarın ve 5.18.1-5.18-5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi akış analizöründeki her kuyunun 50 μL’sini okuyun.