Estabelecendo Culturas Binárias Estáveis de Saccharibacterias simbióticas da Cavidade Oral

Ao desenvolver esse protocolo, foi solicitada e aprovada a aprovação do IRB (#14-10) e o consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos. 1. Preparação Ao trabalhar com seres humanos, obtenha aprovação necessária do IRB e consentimento informado. Inicie culturas de bactérias hospedeiras com tempo suficiente para crescer até a fase estacionária inicial. Por exemplo, inocular 2-5 mL de caldo de soja tripptic com extrato de levedura de 0,1% adicionado (TSBY) com propionica de aracnia e incubar a 37 °C por 24 h. Monte os suportes do filtro com a membrana do filtro de 0,2 μm gravada. Enrole o conjunto em papel alumínio e esterilize autoclaving. Esterilizar tubos de centrífuga e conjuntos de tampas. 2. Obter amostra de bactérias orais NOTA: Enquanto muitas amostras orais contêm Sacaribacterias (por exemplo, saliva, cotonetes de amígdalas, raspas de língua) a placa dentária rotineiramente é a mais bem sucedida. Pegue uma placa raspando usando um ponto de papel estéril, curette gracey, ou, se auto-amostragem, use um palito de dente estéril ou ponta de pipeta. Transferir placa para um buffer adequado, como diluente de recuperação máxima (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% peptone) ou PBS. Se não for processado imediatamente, mantenha a amostra no gelo até que esteja pronta para prosseguir. Resuspenque vigorosamente a placa dentária no tampão MRD usando uma combinação de vórtice e pipetação com uma pequena ponta de tubulação. Adicione a amostra de placa resuspended a um adicional de 9 mL de buffer MRD. 3. Prepare o filtrado da amostra oral Usando técnica asséptica, desembrulhe um conjunto de filtro estéril. Desembrulhar uma curva de quarto e retighten o suporte do filtro para ter certeza de que os fios estão devidamente ligados e o aparelho está fechado corretamente. Usando uma seringa, lave a membrana passando 10 mL de tampão mrd através do aparelho. A montagem inadequada é revelada nesta etapa pelo fluido que vaza do suporte do filtro. Se ocorrer vazamento, obtenha outro conjunto de filtro estéril e repita a etapa de lavagem. Aplique a amostra no filtro lavado. Remova o êmbolo de uma seringa e fixe-o no aparelho do filtro. Despeje a amostra dentária dispersa, agora em 10 mL de tampão mrd, em uma seringa e carregue-a no filtro. Coloque um tubo de centrífuga estéril sob o aparelho do filtro para capturar o filtrado e, em seguida, aplique pressão leve no êmbolo para empurrar a amostra através do filtro. Repita o procedimento com mais 10 mL de tampão mrd para lavar a membrana, coletando o fluxo através no mesmo tubo da amostra filtrada. Asepticamente tampa o tubo. 4. Concentrar células de sacaribacteria por centrifugação Faça uma marca de orientação no tubo e na tampa e coloque o tubo em uma centrífuga de alta velocidade com a marca na parte superior. A pelota formada a partir da centrifugação é geralmente invisível. A marcação ajudará a determinar onde a pelota das células saccharibacteria está localizada quando a centrifugação é feita e o tubo removido da centrífuga. Centrifugar as amostras a 60.000 x g por 1 h a 4 °C.NOTA: Esta força e tempo são suficientes para doar todas as células de Saccharibacteria. No entanto, as células saccharibacteria podem ser pelo menos parcialmente pelotas por centrifugação por apenas 20 min a 20.000 x g. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga. Despeje o líquido do tubo, mantendo a pelota na parte superior do tubo. Resuspend a pelota geralmente invisível em 1-2 mL de buffer MRD por vórtice vigoroso. 5. Infectar culturas de hospedagem com filtrado enriquecido com sacaribacteria Prepare tubos de cultura aliquoting 2 mL de mídia de crescimento apropriada (por exemplo, TSBY, BHI, etc.) em tubos. Adicione 200 μL de cultura durante a noite de organismos hospedeiros a cada tubo. Adicione 100-200 μL de amostra resuspended, filtrada a cada tubo. Incubar amostras combinadas conforme apropriado para o organismo hospedeiro (por exemplo, 37 °C, em atmosfera aeróbica para A. propionica). Transfira as células a cada dois ou três dias transferindo 200 μL de cultura binária para 2 mL de meio de crescimento fresco em um novo tubo. Se parece que as culturas passagens não mostram crescimento (ou seja, a turbidez/densidade óptica da cultura não aumenta após a passagem para a mídia fresca) as Saccharibacterias podem estar sobrecarregando ou matando todo o organismo hospedeiro. Para remediar isso, adicione 200 μL de cultura de host não infectada ao passar as células. Repita por pelo menos 5 passagens. 6. Confirmar infecção por PCR Após 5 passagens, confirme a infecção com PCR. Cinco passagens garantirão que quaisquer células saccharibacteria não em crescimento tenham sido esgotadas além do limite de detecção usando 25 ciclos de PCR. Prepare um mastermix pcr. Uma receita sugerida usando é a seguinte, para cada tubo necessário, prepare 12,5 μL 2x pcr tampão, 0,75 μL 10 μM Primer para frente (580F12 – AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 primer reverso μM (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT CCT TCC TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 e 9 μL de água. Misture por vórtice. Aliquot 24 μL de mastermix em um tubo PCR de 0,2 mL. Adicione 1 μL de cultura infectada por sacaribacteria à reação do PCR. Coloque o tubo em um termociclador e realize o seguinte protocolo: Denaturação inicial 95 °C para 5 min, 25 ciclos de 95 °C para 30 s, 60 °C para 30 s, 72 °C para 30 s, alongamento final a 72 °C por 2 min, depois espera final em 4 °C. Carregue e execute os produtos PCR em um gel de 1% de agarose. Uma banda de ~600 bases indicará a presença de Saccharibacteria. 7. Verifique se há pureza e remova organismos contaminantes Confirme a pureza das culturas positivas ao emplacar a cocultura de Saccharibacteria em ágar nutrientes suficientes para o crescimento do organismo hospedeiro. Realize uma diluição serial de 10 vezes da cultura em tampão estéril (por exemplo, MRD ou PBS) e espalhe 100 μL em uma placa de ágar. Realizar diluições de tal forma que haverá aproximadamente 20-200 colônias crescendo na placa de ágar. Incubar a cultura em condições adequadas de crescimento e observar para contaminar organismos.NOTA: Colônias de sacaribacterias axenic nunca foram observadas, por isso apenas o organismo hospedeiro é observado crescendo nessas placas. Mais de um tipo de colônia geralmente indica contaminação. Caso ocorra contaminação, a cultura deve ser refil filtrada para remover os contaminantes indesejados e re-inoculada em hospedeiro fresco. Ocasionalmente, ocorre uma dupla infecção, onde duas espécies de Saccharibacteria infectam o mesmo hospedeiro. Para separar as espécies de Saccharibacteria, resuspenque colônias individuais em PBS estéreis de 20 μL e use 1 μL de suspensão em uma reação pcr para detectar colônias com infecções por Sacaribacteria. Transfira as suspensões que deram um resultado positivo ao meio de crescimento para iniciar uma cultura binária. A taxa de sucesso dependerá do título de cada espécie de Saccharibacteria na cultura. Pode ser necessário selecionar mais de 50 colônias para encontrar uma infectada para propagação. 8. Armazenamento de culturas Cresça uma cultura binária de volume suficiente (10-50 mL) durante a noite. Células de pelotização por centrifugação (4.000 x g por 10 min).NOTA: A centrifugação de alta velocidade não é necessária aqui, pois as células saccharibacterias serão anexadas às células maiores e mais pesadas do hospedeiro e serão pelotas com elas. Células resuspend em crioprotetor. A mídia de crescimento complementada com 5% de DMSO ou 20% de glicerol é geralmente suficiente. Certifique-se de que o organismo hospedeiro é compatível com mídia crioprotetor (por exemplo, o crescimento da propionica A. é inibido por glicerol e os estoques congelados podem não reviver). Teste a viabilidade de uma cultura hospedeira não infectada com crioprotetor para garantir que os estoques possam sobreviver ao congelamento. Resuspend pelotas de célula no mesmo volume de cultura (10-50 mL). Alíquota de 0,5 mL em criovias rotuladas. Congele as culturas celulares a -80 °C.