Мы демонстрируем метод выделения трудновоспроизводимых членов нового бактериального типа, Saccharibacteria, путем фильтрации зубного налета и совместного культивирования с бактериями-хозяевами.
Многие виды бактерий не могут быть культивированы в лаборатории с использованием стандартных методов, что создает значительный барьер для изучения большинства микробного разнообразия на Земле. Требуются новые подходы к культивированию этих некукультурных бактерий, чтобы исследователи могли эффективно изучать их физиологию и образ жизни, используя мощные инструменты, доступные в лаборатории. Излучение кандидата Phyla (CPR) является одной из крупнейших групп некультивированных бактерий, составляющих ~ 15% живого разнообразия на Земле. Первым изолятом этой группы был член типа Saccharibacteria, штамм‘Nanosynbacter lyticus’TM7x. TM7x представляет собой необычно маленькую бактерию, которая живет как симбионт в прямом контакте с бактериальным хозяином, Schaalia odontolytica, штаммом XH001. Воспользовавшись необычно малым размером клетки и ее образом жизни в качестве симбиотического организма, мы разработали протокол для быстрого культивировать сахариобактерии из зубного налета. Этот протокол покажет, как фильтровать суспензию зубного налета через фильтр 0,2 мкм, затем концентрировать собранные клетки сахарибактерий и заражать культуру организмов-хозяев. Полученная кокультура может быть прошедшей, так как любая нормальная бактериальная культура и инфекция подтверждается ПЦР. Полученная бинарная культура может быть сохранена в лаборатории и использована для будущих экспериментов. Хотя загрязнение возможно, бинарная культура может быть очищена либо путем дальнейшей фильтрации и повторного заражения хозяина, либо путем покрытия бинарной культуры и скрининга на инфицированные колонии. Мы надеемся, что этот протокол может быть распространен на другие типы образцов и среды, что приведет к выращиванию гораздо большего количества видов в СЛР.
Культивирование новых видов бактерий и их попадание в лабораторию позволяет проводить мощные эксперименты, чтобы лучше понять их физиологию и более широкие взаимодействия в их микробном сообществе. Хотя существуют свободные от культуры методы опроса этих вопросов (например, «метаомика»), сложные взаимодействия различных микробных популяций затрудняют различение отдельных переменных и достижение значимых выводов. В то время как культивирование бактерий имеет много преимуществ, существует много потенциальных барьеров для выделения бактерии и выращивания ее в чистой культуре. Потенциальные специфические требования к росту включают рН, напряжение кислорода, витамины, факторы роста, сигнальные молекулы или даже прямой клеточный контакт для получения роста1. Тем не менее, считается, что специфические ауксотрофии являются основным сдерживающим фактором для культивирования новых видов бактерий. В стандартных составах сред отсутствуют многие питательные вещества, необходимые некультивированным бактериям, такие как специфические витамины или источники углерода. Эти недостающие молекулы могут быть ключом к физиологии некультурных бактерий и обычно обеспечиваются либо другим организмом в микробном сообществе, либо организмом-хозяином. Например, сложные углеводы, такие как муцины, могут быть предоставлены животными-хозяевами. Добавление их в жижи позволило культивировать несколько бактерий из кишечника животных, включая Akkermansia muciniphila и Mucinivorans hirudinis2,3,4. Многие патогенные бактерии развили способность использовать железо, связанное с гемином в клетках животных, включая пероральный патоген Porphyromonas gingivalis5. В лабораторных условиях рост порфиромон и других организмов, может быть стимулирован добавлением гемина6.
В последнее время многие прорывы в культивировании новых изолятов бактерий пришли через совместное культивирование, используя «питательный» организм для обеспечения специфических факторов для некуляционных бактерий, необходимых для их роста. Элегантное исследование Вартукяна и его коллег показало, что сидерофоры, молекулы, связывающие железо, продуцируемые бактериями, стимулируют рост нескольких новых пероральных изолятов. Было показано, что пиовердины, тип сидерофора, продуцируемого видамипсевдомонад, значительно облегчают рост нового вида Prevotella 7. В том же исследовании был культивирован первый пероральный изолят для типа Chloroflexi, также использующий F. nucleatum в качестве помощника для предоставления некоторого еще неизвестного соединения7. Совсем недавно бактерия из рода Ruminococcaceae была выделена с использованием Bacteroides fragilis в качестве организма-помощника8. Позже было показано, что гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), ингибирующая нейротрансмиттер, необходима для роста на лабораторных средах. Использование питающих организмов оказалось ключевой стратегией для имитации конкретных микросред, где растут некультивируемые бактерии, будучи более эффективной, чем непрерывное переформулирование питательных сред с различными добавками в различных концентрациях.
Одна из самых больших групп некульвулированных бактерий находится в «Candidate Phyla Radiation» (CPR), монофилетической группе из нескольких потенциальных бактериальных типов9,10. На момент написания этой статьи только члены типа Saccharibacteria в слизи были успешно культивированы в лаборатории. Первый изолят, штамм‘Nanosynbacter lyticus’ TM7x, был выделен с использованием антибиотика стрептомицина, который, как было предсказано, обогатит некультурный TM711,12. Ключевым открытием этой работы было то, что новый изолят вырос как паразит, растущий в прямом контакте с бактериальным хозяином, Schaalia odontolytica,и микроскопия показала, что эти паразиты были ультрамалыми бактериями.
Используя эти подсказки, мы разработали метод быстрого установления бинарных кокультур сахариобактерий с их партнерами путем фильтрации зубного налета и других образцов полости рта через фильтр 0,2 мкм, сбора клеток в фильтрате путем центрифугирования и использования их для заражения культур бактерий-кандидатов-хозяев. Этот метод имеет то преимущество, что позволяет избежать обогащения культур, которые могут быть перегружены быстрорастущими организмами. Он также избегает использования антибиотиков, которые могут остановить рост либо целевых видов сахариобактерий, либо их хозяев. Используя метод, продемонстрированный здесь, мы успешно культивировали 32 изолята из типа Saccharibacteria.
Наш метод фильтрации зубного налета и применения его к чистым культурам организмов-хозяев в значительной степени основан на более ранних наблюдениях за первыми культивирующимися сахарибактериями, штаммом‘Nanosynbacter lyticus’ TM7x11,14,15. Учитывая небольшой размер клеток, мы пришли к выводу, что они могут быть отделены от зубного налета с помощью фильтра и сконцентрированы центрифугированием. Во-вторых, поскольку эти организмы живут как паразиты, предоставление этим клеткам чистых культур хозяев позволит им войти в симбиоз и расти как бинарные культуры.
Одним из преимуществ этого метода является то, что он не требует культуры обогащения или селективного давления. Штамм TM7xNanosynbacter lyticus культивировали из культуры обогащения с использованием стрептомицина в качестве селективного агента, который, как показало секвенирование, будет эффективным при обогащении сахариобактерий. По случайности, хозяин‘Nanosynbacter lyticus’ Schaalia odontolytica,как известно, устойчив к стрептомицину16. Использование антибиотиков в качестве селективного агента может также предотвратить рост организма-хозяина, что, в свою очередь, предотвратит рост сахариобактерий.
Более серьезная проблема использования культур обогащения заключается в том, что быстрорастущие организмы быстро вытесняют организмы, представляющие интерес. В ротовой полости, например, виды Streptococcus могут быстро расти и, если сахар присутствует в питательной среде, вырабатывать достаточно кислоты для подкисления среды, дополнительно отбирая против организмов, представляющих интерес. Избегая культуры обогащения и селективных антибиотиков, наш метод обеспечивает общий подход, который может быть применен к более широкому спектру сахариобактерий и потенциальных хозяев без осложнений этих других методов.
Есть некоторые препятствия для метода, представленного здесь. Во-первых, этот метод предполагает, что сахариактерии живут в бинарной культуре. Мы не тестировали комбинации троичных или троичных культур, чтобы оценить их эффективность, но, вероятно, есть сахарибактерии, которые требуют факторов роста, которые не может обеспечить один организм-хозяин. Тестирование обширных комбинаций бактерий полости рта, которые могут поддерживать рост сахариобактерий, было бы сложной задачей. Во-вторых, метод предполагает, что все сахариобактерии достаточно малы, чтобы пройти через фильтр 0,2 мкм. Возможно, что другие сахариобактерии больше, чем считалось, и фильтр выбирает против этих организмов. Можно использовать фильтр с большим размером пор, но это рискует позволить большему количество нежелательным бактериям полости рта проникнуть в инфицированную кокультуру. Наконец, очень трудно найти виды-хозяева за пределами тех, которые уже были опубликованы. До сих пор единственными успешными хозяевами являются виды из родов Actinomyces, Schaalia, Arachnia и Cellulosimicrobium,все члены типа Actinobacteria15,17,18. Однако эти хозяева поддерживают только рост специфических сахариактерий. Чтобы культивировать больше видов сахариобактерий, необходимо исследовать гораздо больше хозяев.
Мы надеемся, что метод, представленный здесь, поможет будущим исследованиям сахариобактерий и других организмов СЛР. Метагеномное секвенирование предполагает, что эти организмы также имеют небольшие геномы и подозреваются в том, что они являются симбионтами или полагаются на местное микробное сообщество для снабжения метаболитов и других факторов, имеющих решающее значение для их выживания19. Аналогичная стратегия фильтрации может быть использована для изоляции этих организмов при условии, что они достаточно малы и что их организмы-хозяева могут быть культивированы. Методы, описанные здесь, являются первым шагом к тому, чтобы принести мощные инструменты лабораторной культуры этой большой и разнообразной группе бактерий.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Энн Таннер, Брюса Пастера, Хайке Буасверта, Сюэсонг Хе и Батбилег Бор за полезные обсуждения и за предоставление бактериальных штаммов. Мы благодарим Сьюзан Йост и Джессику Вудс за микробную техническую помощь. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом стоматологических и черепно-лицевых исследований Национальных институтов здравоохранения под номерами R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) и T32 DE007327 (AJC). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Pipette tips – 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
Pipette tips – 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
Pipette tips – 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
Pipette tips – 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Swin-Lok Filter – 47mm | Whatman | 4200400 | |
SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
Syringes – 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |