कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लीशमैनिया के फागोसाइटोसिस की जांच करना
Summary
लीशमैनिया संक्रमण में फागोसाइटोसिस से जुड़े तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है। यहां, हम मेजबान कोशिकाओं के साथ लीशमैनिया बातचीत के दौरान होने वाली शुरुआती घटनाओं का मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।
Abstract
फागोसाइटोसिस एक ऑर्केस्ट्रेटेड प्रक्रिया है जिसमें अलग-अलग चरण शामिल हैं: मान्यता, बाध्यकारी और आंतरिककरण। पेशेवर फागोसाइट्स फागोसाइटोसिस द्वारा लीशमैनिया परजीवी लेते हैं, जिसमें कई मेजबान सेल रिसेप्टर्स द्वारा परजीवी सतहों पर लिगेंड को पहचानना शामिल है। मैक्रोफेज झिल्ली के लिए लीशमैनिया का बंधन पूरक रिसेप्टर प्रकार 1 (सीआर 1) और पूरक रिसेप्टर प्रकार 3 (सीआर 3) और पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स के माध्यम से होता है। लिपोफॉस्फोग्लाइकन (एलपीजी) और 63 केडीए ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी 63) मैक्रोफेज-लीशमैनिया इंटरैक्शन में शामिल मुख्य लिगेंड हैं। मेजबान सेल रिसेप्टर्स द्वारा परजीवी लिगेंड की प्रारंभिक मान्यता के बाद, परजीवी आंतरिक हो जाते हैं, जीवित रहते हैं, और परजीवी रिक्तिकाओं के भीतर गुणा करते हैं। लीशमैनिया-प्रेरित रिक्तिकाओं की परिपक्वता प्रक्रिया में इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं से अणुओं का अधिग्रहण शामिल है, जिसमें मोनोमेरिक जी प्रोटीन रब 5 और रब 7, लाइसोसोमल जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (एलएएमपी -1), लाइसोसोमल जुड़े झिल्ली प्रोटीन 2 (एलएएमपी -2), और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 1 ए /
यहां, हम कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मेजबान कोशिकाओं के साथ लीशमैनिया इंटरैक्शन के दौरान होने वाली शुरुआती घटनाओं का मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, जिसमें (i) बाध्यकारी (ii) आंतरिककरण, और (iii) फागोसोम परिपक्वता शामिल है। संक्रमण के परिणाम के इन निर्धारकों के आसपास के ज्ञान के शरीर को जोड़कर, हम लीशमैनिया संक्रमण के रोगजनन की समझ में सुधार करने और उपन्यास कीमोथेरेप्यूटिक लक्ष्यों के लिए अंतिम खोज का समर्थन करने की उम्मीद करते हैं।
Introduction
लीशमैनियासिस जीनस लीशमैनिया के प्रोटोजोआ परजीवी के कारण एक उपेक्षित उष्णकटिबंधीय बीमारी है, जिसके परिणामस्वरूप कशेरुक मेजबान में नैदानिक अभिव्यक्तियों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम होता है, जिसमें त्वचीय लीशमैनियासिस, म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस और आंत लीशमैनियासिस1 शामिल हैं। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) का अनुमान है कि एक अरब से अधिक लोग जोखिम में हैं, प्रति वर्ष दस लाख से अधिक नए मामलेसामने आते हैं।
लीशमैनिया एसपीपी इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोअन हैं जो मेजबान कोशिकाओं के अंदर जीवित रहते हैं, जिनमें मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाएंशामिल हैं 3. लीशमैनिया-मैक्रोफेज इंटरैक्शन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें कई मेजबान सेल रिसेप्टर्स और परजीवी लिगेंड या तो प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से या पूरक रिसेप्टर्स 4,5 को शामिल करते हुए ऑप्सोनाइजेशन द्वारा शामिल होते हैं। शास्त्रीय सतह रिसेप्टर्स, जैसे सीआर 1, सीआर 3, मैनोज-फ्यूकोस, फाइब्रोनेक्टिन, टोल-जैसे और मेहतर रिसेप्टर्स, मैक्रोफेज 6,7,8 के लिए परजीवी लगाव की मध्यस्थता करते हैं। ये रिसेप्टर्स लीशमैनिया की सतह पर अणुओं को पहचानते हैं, जिसमें 63 केडीए ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी 63) और ग्लाइकोलिपिड लिपोफॉस्फोग्लाइकन (एलपीजी) 9 शामिल हैं। ये प्रोमास्टिगोट्स की सतह पर सबसे प्रचुर मात्रा में अणु हैं और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विध्वंस में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, स्तनधारी कोशिकाओं में परजीवी संक्रमण की स्थापना के पक्ष में10. परजीवी सतह लिगेंड मैक्रोफेज रिसेप्टर्स से बांधने के बाद, एफ-एक्टिन स्तनधारी कोशिका सतहों पर जमा होता है, परजीवी के आसपास के रूप में वे फागोसाइटोस्ड होते हैं। इसके बाद, यह परजीवी-प्रेरित डिब्बे के गठन की ओर जाता है जिसे पैरासिटोफोरस रिक्तिका (पीवी) कहा जाता है, जो फागोलिसोसोमल विशेषताओं को प्रस्तुत करता है11. एक बार इन फागोलिसोसोम के अंदर, परजीवी जीवित रहने और गुणा के लिए आवश्यक कई परिवर्तनों से गुजरते हैं3.
पीवी का बायोजेनेसिस एक अत्यधिक विनियमित झिल्ली तस्करी प्रक्रिया है जो इस रोगज़नक़ के इंट्रासेल्युलर अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है12. इस डिब्बे का गठन मेजबान एंडोसाइटिक मार्ग के फागोसोम और डिब्बों के बीच अनुक्रमिक संलयन घटनाओं के परिणामस्वरूप होता है। शास्त्रीय कोशिका जीव विज्ञान अध्ययनों से पता चला है कि पीवी की परिपक्वता में मोनोमेरिक जी प्रोटीन रब 5 और रब 7 प्रोटीन का अधिग्रहण शामिल है, जो मुख्य रूप से क्रमशः प्रारंभिक और देर से एंडोसोम परिपक्वता से जुड़ेहैं। इसके अलावा, ये डिब्बे लाइसोसोम से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 और 2 (एलएएमपी 1, एलएएमपी 2), लाइसोसोमल झिल्ली के प्रमुख प्रोटीन घटक और सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़े प्रोटीन 1 ए / स्पष्ट समानता के बावजूद, पीवी गठन15,16 के कैनेटीक्स और इन डिब्बों की आकृति विज्ञान लीशमैनिया प्रजातियों के आधार पर भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, एल मैक्सिकना या एल अमेज़ॅनेंसिस के कारण संक्रमण बड़ी संख्या में परजीवी वाले बड़े डिब्बों के गठन को प्रेरित करता है17. इसके विपरीत, अन्य प्रजातियां, जैसे कि एल ब्राजीलिएंसिस तथा एल शिशु, छोटे रिक्तिकाएं बनाते हैं जिनमें आमतौर पर प्रत्येक रिक्तिका18 में केवल एक या दो परजीवी होते हैं।
मेजबान सेल-लीशमैनिया इंटरैक्शन के आसपास के इस ज्ञान के बावजूद, मेजबान रिसेप्टर्स और परजीवी लिगेंड के बीच संपर्क से शुरू होने वाली प्रारंभिक घटनाओं को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। इन घटनाओं को परजीवी संक्रमण के परिणाम के निर्धारक के रूप में जाना जाता है और परजीवी प्रजातियों पर निर्भर हैं, परजीवी को पहचानने के लिए भर्ती किए गए मेजबान सेल रिसेप्टर्स के प्रकार और मैक्रोफेज सिग्नलिंग मार्गों की सक्रियता19,20। इसलिए, लीशमैनिया-प्रेरित पीवी के बायोजेनेसिस में शामिल अणुओं की पहचान करना और संक्रमण की स्थापना और परिणाम में इन अणुओं द्वारा निभाई गई भूमिका (ओं) को निर्धारित करना आवश्यक है। यहां, हम लीशमैनिया के फागोसाइटोसिस के दौरान होने वाली प्रारंभिक घटनाओं की निगरानी की एक विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें बाध्यकारी, आंतरिककरण, फागोसोम गठन और परिपक्वता शामिल है। यह काम विभिन्न लीशमैनिया प्रजातियों द्वारा प्रेरित पीवी के गठन में पीएलसी, एक्ट, रब 5, रब 7 और एलसी 3 की भागीदारी को स्पष्ट करने में सहायता कर सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग पीवी परिपक्वता में शामिल अन्य प्रोटीन की भागीदारी की जांच करने के लिए किया जा सकता है। भविष्य के अध्ययन लीशमैनिया-होस्ट सेल इंटरैक्शन में शामिल तंत्र के आसपास के ज्ञान का विस्तार करेंगे और उपन्यास कीमोथेरेप्यूटिक रणनीतियों के डिजाइन में योगदान देंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
लीशमैनिया-मैक्रोफेज इंटरैक्शन एक जटिल प्रक्रिया है और इसमें कई चरण शामिल हैं जो रोग के विकास को प्रभावित कर सकते हैं5. अनऑप्सोनाइज्ड लीशमैनिया और मेजबान कोशिकाओं की बातचीत में शामिल त?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सहायता के लिए गोंकालो मोनिज़ इंस्टीट्यूट, फियोक्रूज़ बाहिया, ब्राजील और माइक्रोस्कोपी विभाग को धन्यवाद देते हैं। इस काम को इनोवा-फियोक्रूज नंबर 79700287000 द्वारा समर्थित किया गया था, पीएसटीवी सीएनपीक्यू (305235 / 2019-2) से अनुसंधान में उत्पादकता के लिए अनुदान रखता है। प्लास्मिड कृपया मौरिसियो टेरेबिज़निक, टोरंटो विश्वविद्यालय, सीए द्वारा प्रदान किए गए थे। लेखक अंग्रेजी भाषा संशोधन और पांडुलिपि कॉपीएडिटिंग सहायता के लिए एंड्रिस के वाल्टर को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Riferimenti
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