Скрининг пептидов, которые активируют MRGPRX2 с использованием инженерных HEK-клеток
Summary
Описаны методы генерации библиотеки коротких пептидов, которые могут активировать тучные клетки через рецептор MRGPRX2. Связанные методы просты, недороги и могут быть распространены на другие клеточные рецепторы.
Abstract
Идентификация лигандов, специфичных для терапевтически значимых клеточных рецепторов, имеет решающее значение для многих применений, включая проектирование и разработку новых терапевтических средств. Связанный с Mas рецептор G-белка-X2 (MRGPRX2) является важным рецептором, который регулирует активацию тучных клеток и, таким образом, направляет общий иммунный ответ. Многочисленные лиганды для MRGPRX2 были идентифицированы и включают эндогенные пептиды, такие как PAMP, defensins, LL-37 и другие фрагменты белка (т.е. деградированный альбумин). Дальнейшая идентификация специфических лигандов MRGPRX2 требует скрининга большого количества пептидов (т.е. пептидной библиотеки); однако тучные клетки трудно и дорого поддерживать in vitro и, следовательно, не экономично использовать для скрининга большого количества молекул. В настоящей статье демонстрируется способ проектирования, разработки и экранирования библиотеки небольших пептидных молекул с использованием MRGPRX2, экспрессивных HEK-клеток. Эта клеточная линия относительно проста и недорога в обслуживании и может быть использована для высокопроизводительного анализа in vitro. Чувствительный к кальцию флуоресцентный краситель Fura-2 для маркировки внутриклеточного потока кальция при активации использовался для мониторинга активации. Для расчета концентрации кальция использовалось отношение интенсивности флуоресценции Fura-2 при 510 нм к длинам волн возбуждения 340 и 380 нм. Пептидная библиотека, используемая для проверки этой системы, была основана на секретагоге эндогенного проадреномедуллина N-терминала 12 (PAMP-12), который, как известно, связывает MRGPRX2 с высокой специфичностью и аффинностью. Последующие пептиды были получены с помощью методов усечения аминокислот и аланина, примененных к PAMP-12. Метод, описанный здесь, прост и недорог, но при этом надежен для скрининга большой библиотеки соединений для идентификации связующих доменов и других важных параметров, которые играют важную роль в активации рецепторов.
Introduction
Тустовые клетки являются неотъемлемой частью иммунной системы и играют решающую роль как во врожденных, так и в адаптивных иммунных реакциях. Тучные клетки в основном активируются либо связыванием антигена с иммуноглобулином E (IgE) – рецепторным комплексом FcεRI, либо недавно обнаруженным mas-родственным рецептором G-белка-X2 (MRGPRX2)1. Активация MRGPRX2 была связана с несколькими иммунными и воспалительными заболеваниями, и, следовательно, важно понимать механизм связывания рецептора с его лигандами2. Для этого была разработана библиотека небольших пептидных молекул, которые были экранированы против рецепторов MRGPRX2, которые были чрезмерно экспрессированы в клетках HEK. В ходе исследования библиотека пептидов была построена с использованием простых и универсальных методов сканирования аланина и усечения аминокислот. Сканирование аланина включает в себя замену определенных аминокислот остатком аланина. Аланин, будучи малым и нейтральным, лишает пептид специфических свойств, придающихся замененным остатком, и последовательно подчеркивает значение соответствующих физико-химических свойств аминокислоты в рецепторных взаимодействиях. Напротив, при усечении аминокислот пептидные последовательности устроены таким образом, что в нем отсутствует один или несколько аминокислотных остатков от N-терминала, С-терминала или обоих. Этот набор пептидов был использован для идентификации аминокислотных последовательностей, имеющих решающее значение для связывания MRGPRX2.
Опыт работы с линиями тучных клеток человека (LAD-2) показал, что эти клетки трудно культивировать и поддерживать in vitro:время удвоения в две недели, дорогостоящие средние добавки и прямое внимание, требуемое во время пассажа3. Эти атрибуты делают клетки непригодными для крупномасштабного скрининга потенциальных лигандов. В настоящем описании стабильно трансфектированные HEK-клетки, экспрессивающие рецептор MRGPRX2 (HEK-X2), использовали для скрининга пептидной библиотеки1. Клетки HEK-293 широко используются и изучаются для гетерологии экспрессии поверхностных рецепторов из-за их высокой эффективности трансфекции, более быстрой скорости удвоения и необходимости культивирования недорогих средних добавок в лаборатории4. Протокол трансфекта клеточной линии HEK-293 был продемонстрирован и хорошо известен5. Клетки HEK-293, стабильно экспрессирующие рецептор MRGPRX2 (пассаж 13-19), были активированы пептидами, полученными посредством N-усечения, C-усечения, N+C-усечения и сканирования аланина1. В качестве контроля использовались клетки ДИКОГО ТИПА HEK (HEK-WT) (пассаж 16-21). Внутриклеточное высвобождение кальция при активации контролировали для изучения активации на основе MRGPRX2.
Активация клеток MRGPRX2 сопровождается цитозольной мобилизацией кальция. Это регулируемое внутриклеточное высвобождение кальция в тучных клетках регулируется поступлением кальция в хранилище (SOCE), координируемым молекулой стромального взаимодействия 1 (STIM1); и занимает центральное место в каскаде иммунного ответа6,7. Для определения внутриклеточной концентрации кальция были использованы различные методы, в том числе пластырные зажимы и флуоресцентные красители8. Из всех доступных методов широко используются флуорометрические красители кальция в конъюгации с различными методами обнаружения9. Два типа флуорометрических красителей, которые приобрели интерес, а именно: одноволновые красители, такие как Fluo-4, и логометрические красители с двойной длиной волны, такие как Indo -1 и Fura-2. Преимущество, которое приносят логометрические красители с двумя длинами волн по сравнению с одноволновые красители, заключается в том, что ратиометрические красители корректируют экспериментальные ошибки, такие как загрузка красителя, фотоотбеливание и фокусировка10,11.
Фура-2 ацетоксиметиловый эфир (Fura-2 AM) представляет собой проникающий в клетку зелено-флуоресцентный краситель, возбуждение которого смещается на более низкую длину волны при связывании кальция. Экспериментально Fura-2 возбуждается при 340 и 380 нм, в то время как излучение регистрируется на 510 нм. При связывании кальция интенсивность флуоресценции при 340 нм увеличивается, а интенсивность 380 нм уменьшается, как показано на рисунке 1. Данные представлены в виде отношения интенсивности флуоресценции после возбуждения при 340 нм (F340) к интенсивности после возбуждения при 380 нм (F380), т.е. F340/F380. Соотношение F340/F380 пропорционально внутриклеточному кальцию, значение которого может быть рассчитано по уравнению Гринкевича12. Поскольку флуоресцентный сигнал получается от возбуждения красителя на двух длинах волн (340 нм и 380 нм), отношение флуоресцентных сигналов корректируется для экспериментальных факторов, таких как загрузка красителя, утечка красителя, фотоотбеливание и плотность клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Передача сигналов кальция занимает центральное место в дегрануляции тучных клеток и широко используется в изучении взаимодействий рецептор-лиганд, идентификации лигандов и открытии лекарств14. MRGPRX2 является недавно обнаруженным рецептором тучных клеток, который, как был?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR и LDU хотели бы отметить грант Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC и NSERC-Discovery для этого проекта.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
Riferimenti
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
