Productie van monoklonale antilichamen gericht tegen aminopeptidase N in het varkensdarmslijmvliesepitheel
Summary
Het recombinante antilichaameiwit dat tot expressie komt in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen en monoklonale antilichamen geproduceerd met behulp van traditionele hybridoma-technologie kan het varkensaminopeptidase N (APN) -eiwit herkennen en eraan binden.
Abstract
Porcine aminopeptidase N (APN), een membraangebonden metallopeptidase dat overvloedig aanwezig is in dunne darmslijmvlies, kan een mucosale immuunrespons initiëren zonder enige interferentie zoals lage eiwitexpressie, enzyminactiviteit of structurele veranderingen. Dit maakt APN een aantrekkelijke kandidaat bij de ontwikkeling van vaccins die zich selectief richten op het slijmvliesepitheel. Eerdere studies hebben aangetoond dat APN een receptoreiwit is voor zowel enterotoxigene Escherichia coli (E. coli) F4 als overdraagbare gastro-enteritisvirus. APN is dus veelbelovend in de ontwikkeling van antilichaam-medicijnconjugaten of nieuwe vaccins op basis van APN-specifieke antilichamen. In deze studie vergeleken we de productie van APN-specifieke monoklonale antilichamen (mAbs) met behulp van traditionele hybridoma-technologie en recombinante antilichaamexpressiemethode. We hebben ook een stabiel getransfecteerde ovarium (CHO) cellijn van de Chinese hamster vastgesteld met behulp van pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN en een E. coli-expressie BL21 (DE3) stam met de pET28a (+)-rAbs-APN-vector. De resultaten tonen aan dat antilichamen die tot expressie komen in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen en mAbs geproduceerd met behulp van hybridomen het APN-eiwit kunnen herkennen en eraan kunnen binden. Dit vormt de basis voor verdere opheldering van de APN-receptorfunctie voor de ontwikkeling van therapieën gericht op verschillende APN-specifieke epitopen.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), een maanlichtenzym dat behoort tot de metalloproteïnase M1-familie, fungeert als een tumormarker, receptor en signaalmolecuul via enzymafhankelijke en enzymonafhankelijke routes 1,2. Naast het splitsen van de N-terminale aminozuurresiduen van verschillende bioactieve peptiden voor de regulatie van hun biologische activiteit, speelt APN een belangrijke rol in de pathogenese van verschillende ontstekingsziekten. APN neemt deel aan antigeenverwerking en -presentatie door bijgesneden peptiden die stevig binden aan belangrijke histocompatibiliteitscomplex klasse II-moleculen 2,3. APN oefent ook ontstekingsremmende effecten uit door zich te binden met G-eiwit-gekoppelde receptoren die deelnemen aan meervoudige signaaltransductie, cytokinesecretie moduleren en bijdragen aan Fc-gammareceptor-gemedieerde fagocytose in de immuunrespons 4,5,6,7.
Als een wijd verspreide membraangebonden exopeptidase is APN overvloedig aanwezig in het dunne darmslijmvlies van varkens en is nauw verbonden met receptorgemedieerde endocytose 1,5,8. APN herkent en bindt het spike-eiwit van het overdraagbare gastro-enteritisvirus voor celinvoer en interageert direct met de FaeG-subeenheid van enterotoxigene Escherichia coli F4 fimbriae om bacteriële hechting met gastheercellen te beïnvloeden 9,10,11. APN is dus een potentieel therapeutisch doelwit bij de behandeling van virale en bacteriële infectieziekten.
Sinds de ontwikkeling van hybridoma-technologie en andere strategieën voor de productie van monoklonale antilichamen (mAbs) in 1975, zijn mAbs op grote schaal gebruikt in immunotherapie, medicijnafgifte en diagnose12,13,14. Momenteel worden mAbs met succes gebruikt om ziekten te behandelen, zoals kanker, inflammatoire darmaandoeningen en multiple sclerose12,15. Vanwege hun sterke affiniteit en specificiteit kunnen mAbs ideale doelwitten zijn bij de ontwikkeling van antilichaam-geneesmiddelconjugaten (ADC) of nieuwe vaccins16,17. Het APN-eiwit is van cruciaal belang voor het selectief afleveren van antigenen aan specifieke cellen en kan een specifieke en sterke mucosale immuunrespons tegen pathogenen veroorzaken zonder enige interferentie, waaronder lage eiwitexpressie, enzyminactiviteit of structurele veranderingen 5,8,18. Daarom zijn therapeutische producten op basis van APN-specifieke mAbs veelbelovend tegen bacteriële en virale infecties. In deze studie beschrijven we de productie van APN-specifieke mAbs met behulp van hybridoma-technologie en expressie van anti-APN recombinante antilichamen (rAbs) met behulp van prokaryote en eukaryote vectoren. Het resultaat geeft aan dat het APN-eiwit werd herkend door zowel rAbs uitgedrukt in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen als hybridoom-afgeleide mAbs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inductie van mucosale immuniteit is een van de meest effectieve benaderingen bij het tegengaan van pathogenen en bij het voorkomen en behandelen van verschillende ziekten. APN, een sterk tot expressie gebracht membraangebonden eiwit in het darmslijmvlies, is betrokken bij de inductie van adaptieve immuunrespons en bij receptorgemedieerde virale en bacteriële endocytose 1,5,8. APN wordt gebruikt als antigeendeeltjes in vele form…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Chinese National Science Foundation Grant (nr. 32072820, 31702242), subsidies van Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) en High-level Talents van Yangzhou University Scientific Research Foundation, een project opgericht door het Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
Riferimenti
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient’s need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
