Trata-se de protocolos de coleta e microinjeção de embriões pré-celulares de cigarrinhas de milho com a finalidade de modificar seu genoma via edição genômica baseada em CRISPR/Cas9 ou para a adição de elementos transponíveis marcados por meio de transformação germinativa.
A cigarrinha do milho, Peregrinus maidis, é praga do milho e vetor de vários vírus do milho. Métodos publicados anteriormente descrevem o desencadeamento de RNA de interferência (RNAi) em P. maidis através da microinjeção de RNAs de fita dupla (dsRNAs) em ninfas e adultos. Apesar do poder do RNAi, os fenótipos gerados por essa técnica são transitórios e carecem de herança mendeliana a longo prazo. Portanto, a caixa de ferramentas de P. maidis precisa ser expandida para incluir ferramentas genômicas funcionais que permitam a produção de linhagens mutantes estáveis, abrindo as portas para que os pesquisadores tragam novos métodos de controle para essa praga economicamente importante. No entanto, ao contrário dos dsRNAs usados para RNAi, os componentes usados na edição do genoma baseada em CRISPR/Cas9 e transformação germinativa não atravessam facilmente as membranas celulares. Como resultado, DNAs, RNAs e/ou proteínas plasmidiais devem ser microinjetados em embriões antes que o embrião se celularize, tornando o momento da injeção um fator crítico para o sucesso. Para esse fim, um método de oviposição à base de agarose foi desenvolvido para permitir a colheita de embriões de fêmeas de P. maidis em intervalos relativamente curtos. Neste trabalho são fornecidos protocolos detalhados para coleta e microinjeção de embriões pré-celulares de P. maidis com componentes CRISPR (nuclease Cas9 complexada com RNAs-guia), e resultados de knockout genético baseado em Cas9 de um gene cor de olho de P. maidis, branco, são apresentados. Embora esses protocolos descrevam a edição do genoma CRISPR/Cas9 em P. maidis, eles também podem ser usados para produzir P. maidis transgênico via transformação germinativa simplesmente alterando a composição da solução de injeção.
A cigarrinha-do-milho, Peregrinus maidis, é uma praga economicamente importante do milho 1,2,3. Causam danos físicos diretos à planta, tanto durante a alimentação com suas partes bucais sugadoras de piercing, quanto durante a reprodução, quando depositam seus embriões diretamente no tecido vegetal 2,4. Apesar das múltiplas rotas de danos diretos às culturas, o maior impacto desses insetos na sanidade das culturas é indireto, atuando como vetor do vírus do mosaico do milho (MMV) e do vírus da listra do milho 5,6. A MMV é capaz de se replicar no organismo de seu vetor P. maidis, permitindo que o vírus persista em insetos individuais durante toda a sua vida, para que eles possam continuar a espalhar o vírus para novas plantas hospedeiras 7,8. Os métodos mais comuns para o controle da P. maidis e, portanto, dos vírus por ela vetores, são os inseticidas.
Infelizmente, o mau manejo desses produtos tem ocasionado o desenvolvimento de resistência na praga-alvo, bem como a poluição do meio ambiente9. Portanto, novas estratégias são necessárias para reduzir as perdas nas culturas por essa combinação inseto/vírus-praga. Trabalhos anteriores demonstraram que a interferência de RNA (RNAi) pode ser um método de controle eficaz para P. maidis, pois eles são suscetíveis a downregulation na expressão gênica mesmo quando ingerem RNA de fita dupla (dsRNA)10. No entanto, a maneira mais eficaz de administrar dsRNA no campo seria através das plantas das quais os insetos se alimentam; Assim, as lavouras ainda podem ser suscetíveis a quaisquer vírus que os insetos já estejam carregando. Com o advento da edição do genoma CRISPR/Cas9, novas estratégias de controle de pragas são possíveis, incluindo a unidade gênica baseada em Cas911,12, que poderia ser usada para reduzir o tamanho de uma população de pragas, ou para substituir essa população por indivíduos resistentes aos vírus que eles vetam.
No entanto, o desenvolvimento e a implantação de qualquer tipo de sistema de acionamento de genes exigirá o desenvolvimento de técnicas transgênicas. Tais métodos não foram necessários para a realização de experimentos de RNAi em P. maidis, pois presume-se que os dsRNAs e/ou siRNAs sejam capazes de atravessar as membranas celulares devido à eficiência do RNAi em P. maidis10,13. Isso não é verdade para os DNAs e/ou proteínas empregadas na transgênese tradicional ou na edição genética baseada em Cas9, qualquer uma das quais seria um precursor para a criação de insetos portadores de uma unidade gênica. Para realizar a edição de genes ou outras formas de transformação germinativa, esses DNAs e proteínas são idealmente microinjetados em embriões durante o estágio de blastoderma sincicial, antes de quando o embrião do inseto se celulariza. O tempo é crítico, pois o estágio sincicial é a parte mais precoce do desenvolvimento14,15. Como as fêmeas de P. maidis colocam preferencialmente seus ovos no tecido vegetal, a extração de quantidades suficientes de embriões pré-celulares para microinjeções pode ser trabalhosa e demorada. Assim, novas técnicas foram desenvolvidas para coletar e microinjetar rapidamente embriões de P. maidis antes da celularização.
Qualidade e nutrição da postura de ovos
Recentemente, pesquisadores que trabalharam com uma espécie relacionada, Nilaparvata lugens, obtiveram os ovos que usaram para microinjeções diretamente da folha, mantendo os ovos injetados no tecido foliar até eclodirem17. Embora esse método à base de folhas tenha proporcionado um ambiente mais natural para o desenvolvimento embrionário, também aumentou as chances de infecções e danos aos ovos durante o processo de remoção. O sistema de oviposição artificial aqui apresentado proporciona um ambiente mais uniforme e reduz as chances de danos aos ovos decorrentes do manuseio. Ao montar as taças de oviposição na sexta-feira, a maioria dos ovos ovipositados foi coletada durante uma semana de trabalho típica, em benefício daqueles que fazem o trabalho de microinjeção. Uma ressalva a esse método, no entanto, é que a falta de nutrientes na dieta com solução de sacarose a 10% acabará afetando a saúde dos insetos, e as fêmeas nas xícaras geralmente começam a morrer após apenas 10 dias. A qualidade dos ovos também começa a cair após 6 dias, como evidenciado por um aumento de ovos mortos ou com aparência insalubre. Como resultado, é importante ser seletivo dos ovos usados para microinjeções e não manter as fêmeas após o dia 6.
Taxa de sobrevivência e umidade
Dois fatores parecem ser críticos para a sobrevivência embrionária através do processo de microinjeção. O aspecto mais desafiador do manuseio de embriões de P. maidis é evitar que eles se dessecem após a remoção do meio de oviposição e durante a microinjeção. Como os ovos são normalmente colocados dentro do tecido vegetal, eles não têm uma casca adequada para evitar a desidratação. Mesmo na capuz umidificada, conjuntos inteiros de ovos foram perdidos devido à dessecação. No entanto, umidade excessivamente alta também pode afetar as microinjeções se a água se acumular na fita dupla face ou no escopo. Infelizmente, a desidratação dos ovos geralmente não era fácil de notar durante o processo de microinjeção, e eles frequentemente pareciam normais até 2 ou 3 dias depois, quando se tornaram completamente transparentes, não mostrando sinais de desenvolvimento.
A qualidade da agulha também parece desempenhar um papel importante na sobrevivência. A agulha deve ser chanfrada para minimizar danos desnecessários ao ovo. Quando a agulha é bloqueada, utilizar a função de limpeza no injetor enquanto acaricia suavemente a ponta da agulha com um pincel humedecido (ver passo 4.7) normalmente devolveu a agulha a um estado funcional. Independentemente disso, recomenda-se colocar apenas pequenas quantidades de solução de injeção (~0,25 μL) em cada agulha e mudar para uma nova agulha a cada poucas lâminas (~50-60 ovos) para garantir que a qualidade da agulha seja mantida durante todo o processo de injeção.
Geração bem-sucedida de um fenótipo nocaute
Para transformar com sucesso as células germinativas, as microinjeções embrionárias geralmente precisam ser feitas o mais cedo possível antes da celularização. Dependendo da espécie de inseto, a janela de tempo para completar as microinjeções varia de apenas algumas horas a até um dia inteiro14,15,20. Ainda não está claro quando os embriões de P. maidis sofrem celularização. O knockout mediado por Cas9 foi testado em embriões de até 4 h pós-oviposição (pel) a até 16 h pel, e os fenótipos esperados foram observados em todos os experimentos, sugerindo que todas as microinjeções foram realizadas dentro da janela de pré-celurização.
O ortólogo de P. maidis do gene da cor dos olhos, branco, foi selecionado porque se esperava que o fenótipo knockout fosse fácil de rastrear em injetados devido à sua natureza celular-autônoma. De fato, como esperado, tanto o mosaico quanto o knockout total foram claramente identificáveis entre os embriões que receberam a mistura injetável contendo Cas9 e RNAs guia. Infelizmente, nenhum injetado com nocaute completo eclodiu, e um acasalamento em massa de injetados sobreviventes não conseguiu gerar descendência de olhos brancos. No entanto, uma linhagem mutante foi posteriormente gerada com sucesso ao atingir um gene diferente (Klobasa et al., em andamento). Isso sugere que a falha em estabelecer uma linhagem mutante branca é provavelmente devido a efeitos fora do alvo (ou seja, Cas9 cortando regiões importantes em outras partes do genoma) gerando uma mutação letal intimamente ligada, ou a um papel crítico imprevisível para o branco em P. maidis.
Dados fenotípicos e moleculares (Figura 8 e Figura 9) afirmam que um knockout significativo no locus branco foi criado em uma amostra de embriões injetados, o que resultaria em perda total da função gênica. Além disso, embora mutações em branco sejam viáveis em algumas espécies, há precedentes para que a redução da atividade branca seja prejudicial21,22. Dito isso, efeitos fora do alvo não podem ser completamente descartados. A previsão de prováveis off-targets requer dados precisos de sequência do genoma23, o que o estado atual dos recursos genômicos em P. maidis torna impossível de fazer neste momento. Independentemente disso, com esses novos métodos, o teste de outros genes-alvo pode ser feito com confiança, até mesmo avançando para a transgênese mais tradicional, em um esforço para trazer novas ferramentas genéticas para essa praga perniciosa.
The authors have nothing to disclose.
A Universidade Estadual da Carolina do Norte, Departamento de Entomologia e Fitopatologia, faz parte de uma equipe que apoia o Programa de Aliados de Insetos da DARPA. Os pontos de vista, opiniões e/ou descobertas expressas são dos autores e não devem ser interpretados como representando os pontos de vista ou políticas oficiais do Departamento de Defesa ou do Governo dos EUA. Os autores declaram não haver interesses concorrentes. MDL, DR e AEW conceberam o projeto e forneceram financiamento, administração do projeto e recursos. FC, WK, NG e MDL conceberam e projetaram os experimentos de microinjeção; OH concebeu e projetou o método de oviposição. FC e WK realizaram os experimentos; FC e WK analisaram os resultados; e FC, WK, NG e MDL escreveram o manuscrito. Os autores gostariam de fazer um agradecimento especial a Kyle Sozanski e Victoria Barnett por sua ajuda na manutenção das colônias de P. maidis.
1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |